Nuacht

Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tacaíocht teoranta CSS ag an leagan brabhsálaí atá in úsáid agat.Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, cuirfimid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Úsáidtear modhanna lipéadaithe cóngarachta einsímeacha atá bunaithe ar eistir gníomhachtaithe nó fréamhacha feinocsa go forleathan chun próitéamaí fo-cheallacha agus idirghníomhaithe próitéine i gcealla beo a mhapáil.Mar sin féin, níl an t-eistir gníomhachtaithe níos lú imoibríoch, rud a fhágann go bhfuil ga lipéadaithe leathan ann, agus is féidir le radacacha feinocsa a ghintear trí chóireáil sárocsaíd cur isteach ar bhealaí redox.Anseo tuairiscímid modh fótaghníomhaithe cleithiúnaí lipéadaithe gaireachta (PDPL) a forbraíodh trí phróitéin photosensitizer miniSOG a nascadh go géiniteach le próitéin inspéise.Arna spreagadh ag solas gorm agus á rialú ag am nochta, gintear ocsaigin singil agus ansin baintear amach lipéadú spásúil réitithe ar iarmhair histidine ag an taiscéalaí ainilín.Léirímid a dhílseacht ard trí mhapáil próitéamaí a bhaineann go sonrach le horgán.Léiríonn comparáid taobh le taobh PDPL le TurboID clúdach próitéamaíche níos sainiúla agus níos cuimsithí ar PDPL.Ina dhiaidh sin, chuireamar PDPL i bhfeidhm ar an gcomhghníomhaí trascríobh BRD4 agus E3 Parkin ligase a bhaineann le galair agus d’aimsíomar idirghníomhaithe nach raibh aithne orthu roimhe seo.Trí scagadh ró-léirithe, aithníodh dhá fhoshraith anaithnid, Ssu72 agus SNW1, do Parkin, a ndéantar a dhíghrádú a idirghabháil ag an gcosán ubiquitination-proteasome.
Tá tréithriú cruinn líonraí próitéine mar bhunchloch ag go leor próisis cheallacha bunúsacha.Dá bhrí sin, soláthróidh mapáil spásúil an-chruinn ar idirghníomhaíochtaí próitéine bonn móilíneach chun cosáin bhitheolaíocha, paiteolaíocht galair a dhíchóimeáil, agus chun cur isteach ar na hidirghníomhaíochtaí sin chun críocha teiripeacha.Chuige sin, tá sé an-inmhianaithe modhanna atá in ann idirghníomhaíochtaí ama a bhrath i gcealla beo nó fíocháin.Úsáideadh Mais-speictriméadracht um Íonú Cleamhnais (AP-MS) go stairiúil chun comhpháirtithe ceangailteacha de phróitéiní inspéise (POIanna) a shainaithint.Le forbairt modhanna próitéamaíocha cainníochtúla, cruthaíodh Bioplex3.0, an bunachar sonraí is mó de líonraí próitéine bunaithe ar AP-MS.Cé go bhfuil AP-MS an-chumhachtach, tá na céimeanna lysis cille agus caolaithe sa sreabhadh oibre claonta i dtreo idirghníomhaíochtaí ceangailteacha laga agus neamhbhuan agus tugtar isteach déantáin iar-lysis cosúil le péirí idirghníomhaíochta spurious a bhfuil easpa roinnte acu roimh an lysis.
Chun aghaidh a thabhairt ar na saincheisteanna seo, forbraíodh aimínaigéid mhínádúrtha (UAA) le grúpaí trasnasctha agus ardáin lipéadaithe einsímeacha in aice láimhe (m.sh. APEX agus BioID)5.Cé gur cuireadh an modh UAA i bhfeidhm go rathúil i go leor cásanna agus go gcuireann sé faisnéis ar fáil maidir le greamacháin dhíreacha próitéine, tá gá fós le leas iomlán a bhaint as suíomh isteach UAA.Níos tábhachtaí fós, is modh lipéadaithe stoichiometric é nach bhfuil aisiompú catalaíoch ann ar imeachtaí lipéadaithe.I gcodarsnacht leis sin, comhcheanglaíonn modhanna PL einsímeacha, mar an modh BioID, an ligáis biotin innealtóireachta go POI7, a ghníomhaíonn biotin ina dhiaidh sin chun eistir imoibríoch biotinyl-AMP a fhoirmiú.Dá bhrí sin, catalaíonn agus scaoileann an einsím “scamall” biotin gníomhachtaithe a chuireann lipéad ar iarmhair lísín cóngaracha.Mar sin féin, éilíonn BioID níos mó ná 12 uair an chloig chun comhartha lipéadaithe dóthanach a fháil, rud a chuireann cosc ​​ar é a úsáid le taifeach ama.Ag baint úsáide as éabhlóid dírithe bunaithe ar thaispeántas giosta, dearadh TurboID bunaithe ar BioID chun a bheith níos éifeachtaí, rud a cheadaíonn lipéadú éifeachtach le biotin laistigh de 10 nóiméad, rud a fhágann gur féidir staidéar a dhéanamh ar phróisis níos dinimiciúla.Toisc go bhfuil TurboID an-ghníomhach agus gur leor na leibhéil biotin inghin le haghaidh lipéadú íseal-leibhéil, is fadhb a d’fhéadfadh a bheith ann maidir le lipéadú cúlra nuair a bhíonn gá le lipéadú an-fheabhsaithe agus uainithe trí bhiotín eisghineach a chur leis.Ina theannta sin, tá droch-imoibríocht ag eistir gníomhachtaithe (t1/2 ~ 5 min), rud a d'fhéadfadh ga mór lipéadaithe a bheith mar thoradh air, go háirithe tar éis sáithiú próitéiní comharsanacha le biotin 5. I gcur chuige eile, déantar comhleá géiniteach ascorbate peroxidase innealtóireacht (ie biotin-). Fréamhacha feanóil agus ceadaíonn sé lipéadú próitéin laistigh de nóiméad9, 10. Úsáidtear APEX go forleathan chun próitéamaí subcellular, coimpléisc próitéin membrane, agus coimpléisc próitéin comharthaíochta citosólacha11,12 a aithint.Mar sin féin, is féidir leis an ngá atá le tiúchan ard sárocsaídí difear a dhéanamh ar phróitéiní nó ar bhealaí redox, ag cur isteach ar. próisis cheallacha.
Mar sin, cuirfear go mór leis na modhanna atá ann cheana féin modh nua a bheidh in ann speicis faoi chois lipéadaithe-gha níos imghníomhaí a ghiniúint le cruinneas ard spáis agus ama gan cur isteach go mór ar bhealaí ceallacha. I measc na speiceas imoibríoch, d'ardaigh ocsaigin singlet ár n-aird mar gheall ar a shaolré gearr agus ga idirleata teoranta (t1/2 < 0.6 µs i gcealla)13. I measc na speiceas imoibríoch, d'ardaigh ocsaigin singlet ár n-aird mar gheall ar a shaolré gearr agus ga idirleata teoranta (t1/2 < 0.6 µs i gcealla)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. I measc na bhfoirmeacha gníomhacha, tharraing ocsaigin singlet ár n-aird mar gheall ar a shaolré gearr agus ga idirleata teoranta (t1/2 < 0.6 µs i gcealla)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6赌漨漨漨漉 1/2 < 0.6 µs) 1/2 < 0.6 µs) Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). I measc foirmeacha gníomhacha, tarraingíonn ocsaigin singlet ár n-aird mar gheall ar a saolré gearr agus ga idirleata teoranta (t1/2 < 0.6 μs i gcealla).Tuairiscíodh go ndéanann ocsaigin Singlet ocsaídiú randamach ar mheitiainín, tyrosine, histidine agus tryptophan, rud a fhágann go bhfuil sé polar 14,15 chun gabháil le tóireadóirí aimín nó thiol16,17.Cé gur úsáideadh ocsaigin singil chun RNA urrann fhocheallach a lipéadú, níl aon taiscéalaithe fós ar straitéisí chun marcóirí gaireachta POI ingenous a athúsáid.Anseo, cuirimid ardán i láthair ar a dtugtar lipéadú gaireachta atá ag brath ar fhótaghníomhaíocht (PDPL), áit a n-úsáidimid solas gorm chun POIanna atá comhleádh le photosensitizer miniSOG a shoilsiú agus giniúint ocsaigine singlet a spreagadh chun iarmhair chóngaracha a ocsaídiú, agus modhnuithe ina bhfuil aimín ina dhiaidh sin chun tóireadóirí ceimiceacha a ocsaídiú isteach. cealla beo idirmheánach..Rinneamar tástáil ar ghrúpa taiscéalaithe ceimiceacha chun sainiúlacht na gclibeanna a uasmhéadú agus sainaithníodh suíomhanna modhnuithe trí úsáid a bhaint as sreabhadh oibre próitéamaíocht oscailte.Léiríonn comparáid taobh le taobh PDPL le TurboID clúdach próitéamaíche níos sainiúla agus níos cuimsithí ar PDPL.Chuireamar an cur chuige seo i bhfeidhm ar mharcóirí orgán-shonracha den phróitéam focheallach agus sainaithint ghinearálta próitéamaí na gcomhpháirtithe ceangailteacha don phróitéin rialála epigenetic BRD4 a bhaineann le hailse agus an E3 ligáis Parkin a bhaineann le galar Parkinson, a dheimhnigh líonra próitéine aitheanta agus anaithnid. idirghníomhaíochtaí..Léiríonn cumas PDPL foshraitheanna E3 a aithint i gcoimpléisc mhóra próitéine staid ina bhfuil gá le nascóirí indíreacha a aithint.Deimhníodh dhá fhoshraith anaithnid parkin arna n-idirghabháil ag ubiquitination-proteasome in situ.
Teiripe fhótadinimiciúil (PDT)19 agus díghníomhú léasair crómafór-chuidithe (CALI)20, ina ngineann ionradaíocht solais le fótaisintéiseoirí ocsaigin singil, is féidir leis na spriocphróitéiní a dhíghníomhú nó bás cille a chur faoi deara.Ós rud é gur substaint an-imoibríoch é ocsaigin singlet le fad idirleata teoiriciúil de thart ar 70 nm, is féidir ocsaídiú teoranta ó thaobh spáis timpeall an fhótaisintéiseora a rialú.Bunaithe ar an gcoincheap seo, shocraigh muid ocsaigin singlet a úsáid chun lipéadú dlúth a bhaint amach ar choimpléisc próitéine i gcealla beo.Tá cur chuige ceimiteiripeach PDPL forbartha againn chun ceithre fheidhm a chomhlíonadh: (1) giniúint ocsaigine singil gníomhach cosúil le cur chuige einsímeach PL a chatalú;(2) lipéadú amréiteach a sholáthar ar thionscnamh solais;(3) trí athrú (4) Seachain úsáid a bhaint as comhfhachtóirí ingenous (cosúil le biotin) chun an cúlra a laghdú, nó bain úsáid as imoibrithe eisghineacha atá thar a bheith corraitheach (cosúil le sárocsaídí) chun nochtadh cille do strus comhshaoil ​​a íoslaghdú.
Is féidir fóta-íogairí a roinnt ina dhá chatagóir lena n-áirítear fluarafór ar mheáchan móilíneach beag (m.sh. rós binge, gorm meitiléine)22 agus próitéiní beaga atá ionchódaithe go géiniteach (eg miniSOG, KillerRed)23.Chun dearadh modúlach a bhaint amach, d'fhorbraíomar ardán PDPL den chéad ghlúin trí phróitéiní photosensitizer (PS) a chur le POI24,25 (Fíor 1a).Nuair a bhíonn sé ionradaithe le solas gorm, ocsaídíonn ocsaigin singlet iarmhair aimínaigéad núicléifileach cóngarach, rud a fhágann go bhfuil polaraíocht umpolung leictriafail agus is féidir imoibriú a thuilleadh le núicléifilí aimíneacha16,17.Deartar an taiscéalaí le hanla ailcín chun ceimic chliceáil a cheadú agus chun tarraingt anuas le haghaidh tréithriú LC/MS/MS.
Léiriú scéimreach de lipéadú coimpléisc próitéine arna idirghabháil ag miniSOG.Nuair a bhíonn siad faoi lé solas gorm, gineann cealla a léiríonn miniSOG-POI ocsaigin singlet, a mhodhnaíonn próitéiní idirghníomhacha ach ní próitéiní neamhcheangailteacha.Déantar táirgí idirmheánacha fótaocsaíde a idircheapadh trí lipéid sealaíochta den taiscéalaí ceimiceach aimín chun aidigh chomhfhiúsacha a fhoirmiú.Ligeann an grúpa ailcile ar an taiscéalaí ceimice do cheimic cliceáil saibhriú trí tharraingt anuas agus cainníochtú LC-MS/MS ina dhiaidh sin.b Struchtúr ceimiceach na tóireadóirí aimín 1-4.c Anailís ionadaíoch glóthach fluaraiseacha ar mharcóirí próitéamacha mion-idirghabhála mitochondrial logánaithe ag baint úsáide as tóireadóirí 1-4 agus cainníochtú coibhneasta bunaithe ar dhlúisiméadracht glóthach.Rinneadh measúnú ar an gcóimheas comhartha-go-cúlra de thaiscéalaithe ceimiceacha ag baint úsáide as turgnaimh rialaithe diúltacha gan solas gorm a áireamh nó ag baint úsáide as cealla HEK293T gan léiriú miniSOG.n = 2 shampla atá neamhspleách go bitheolaíoch.Léiríonn gach ponc macasamhail bitheolaíoch.d Brath ionadaíoch agus cainníochtú PDPL ag baint úsáide as taiscéalaí optamaithe 3 i láthair nó in éagmais na gcomhpháirteanna PDPL léirithe amhail c.n = 3 shampla atá neamhspleách go bitheolaíoch.Léiríonn gach ponc macasamhail bitheolaíoch.Is ionann lárlínte agus guairneáin don mheán agus ± diall caighdeánach.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Íomháú comhfhócasach ar ocsaigin singil le smál Si-DMA i bhfad dearg.Barra scála: 10 µm.Rinneadh íomháú glóthach agus turgnaimh chomhfhócasacha a athdhéanamh go neamhspleách ar a laghad dhá uair le torthaí comhchosúla.
Rinneamar tástáil ar dtús ar chumas na bhfóto-sensitizers aibí miniSOG26 agus KillerRed23, arna chur in iúl go seasta in HEK293T, chun lipéadú propargylamine ar an proteome a idirghabháil mar thaiscéalaí ceimiceach (Fíor Forlíontach 1a).Léirigh anailís fluaraiseachta glóthach gur baineadh amach an lipéadú proteome iomlán trí úsáid a bhaint as miniSOG agus ionradaíocht solais ghorm, agus níor breathnaíodh aon táirge lipéadaithe infheicthe le KillerRed.Chun an cóimheas comhartha-go-cúlra a fheabhsú, rinneamar tástáil ansin ar shraith de tóireadóirí ceimiceacha ina raibh ainilín (1 agus 3), próipilamine (2), nó beinsilimín (4).Thugamar faoi deara go raibh comhartha cúlra níos airde ag cealla HEK293T féin i gcomparáid le haon solas gorm, b'fhéidir mar gheall ar an bhfóto-íogair ribeaflaivin ingenous, mononucleotide flavin (FMN) 27 . Thug tóireadóirí ceimiceacha ainilín 1 agus 3 sainiúlacht níos fearr, agus léirigh HEK293T miniSOG go seasta i mitochondria ag taispeáint méadú >8 huaire sa chomhartha do thaiscéalaí 3, agus níor úsáideadh taiscéalaí 2 sa mhodh lipéadaithe RNA CAP-seq ach ~2.5- méadú comhartha fillte, is dócha mar gheall ar roghanna imoibríochta éagsúla idir RNA agus próitéin (Fig. 1b, c). Thug tóireadóirí ceimiceacha ainilín 1 agus 3 sainiúlacht níos fearr, agus léirigh HEK293T miniSOG go seasta i mitochondria ag taispeáint méadú >8 huaire sa chomhartha do thaiscéalaí 3, agus níor úsáideadh taiscéalaí 2 sa mhodh lipéadaithe RNA CAP-seq ach ~2.5- méadú comhartha fillte, is dócha mar gheall ar roghanna imoibríochta éagsúla idir RNA agus próitéin (Fig. 1b, c).Léirigh tóireadóirí ceimiceacha ainilín 1 agus 3 sainiúlacht níos fearr: Léiríonn HEK293T, a chuireann in iúl go cobhsaí miniSOG i mitochondria, níos mó ná méadú 8-huaire ar chomhartha do probe 3, agus taiscéalaí 2, a úsáidtear sa mhodh lipéadaithe RNA CAP-seq, amháin léiríonn ~2.5-huaire méadú comhartha, is dócha mar gheall ar roghanna imoibríocht éagsúla idir RNA agus próitéin (Fíor 1b, c).基于. 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA和蛋白质之间的不同反应偏好 (图1b，c）。).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 的 的 表达 表达 稳定 稳定 表达 表达 表达 探针 探针 探针 的 信号 增加 增加 增加> 8 倍 而 于 于 于 RNA 标记 CAP-EQ 的 2 ~ ~ ~ ~ 2.5 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNABhí sainiúlacht níos fearr ag tóireadóirí ceimiceacha anailín 1 agus 3, léirigh HEK293T miniSOG go seasta i mitochondria, agus bhí méadú 8-huaire ar chomhartha ag probe 3, agus níor léirigh taiscéalaí 2 don mhodh lipéadaithe RNA CAP-seq ach ~2.5 méadú.sa chomhartha, is dócha mar gheall ar roghanna imoibrithe éagsúla idir RNA agus próitéin (Fíor 1b, c).Ina theannta sin, rinneadh tástáil ar isiméirí taiscéalaí 3 agus tóireadóirí hidrazine (probanna 5, 6, 7), ag deimhniú leas iomlán a bhaint as taiscéalaí 3 (Fíor Forlíontach 1b,c).Mar an gcéanna, léirigh anailís fhluaraiseachta in-ghlóthach paraiméadair turgnamhacha optamaithe eile: tonnfhad ionradaíochta (460 nm), tiúchan taiscéalaí ceimiceach (1 mM), agus am ionradaíochta (20 min) (Fíor Forlíontach 2a-c).Mar thoradh ar fhágáil ar lár aon chomhpháirt nó aon chéim sa phrótacal PDPL bhí aisiompú suntasach comhartha chuig an cúlra (Fíor 1d).Go háirithe, laghdaíodh lipéadú próitéine go suntasach i láthair aicíde sóidiam nó trolox, arb eol go n-éireoidh siad as ocsaigin singlet.Cuireann láithreacht D2O, arb eol dó ocsaigin singlet a chobhsú, an comhartha lipéadaithe.Chun imscrúdú a dhéanamh ar rannchuidiú speiceas ocsaigine imoibríoch eile le lipéadú, cuireadh mannitol agus vitimín C leis chun scavengers radacach hiodrocsaile agus superoxide a bhunú, faoi seach, 18, 29, ach níor aimsíodh go laghdódh siad lipéadú.Ní raibh lipéadú mar thoradh ar H2O2 a chur leis, ach gan soilsiú (Fíor Forlíontach 3a).Dhearbhaigh íomháú ocsaigine fluaraiseachta singlet le tóireadóirí Si-DMA láithreacht ocsaigine singlet sa sreang HEK293T-miniSOG, ach ní sa sreang HEK293T bunaidh.Ina theannta sin, níorbh fhéidir le mitoSOX Red táirgeadh superoxide a bhrath tar éis an tsoilsithe (Fíor 1e agus Fíor Fhorlíontach 3b) 30. Tugann na sonraí seo le fios go láidir gurb é ocsaigin singlet an príomhspeicis ocsaigine imoibríoch atá freagrach as lipéadú próitéamaíoch ina dhiaidh sin.Rinneadh measúnú ar chiteatocsaineacht PDPL lena n-áirítear ionradaíocht solas gorm agus tóireadóirí ceimiceacha, agus níor breathnaíodh aon chiteatocsaineacht shuntasach (Fíor Fhorlíontach 4a).
D'fhonn staidéar a dhéanamh ar an meicníocht lipéadaithe agus aithint próitéamaíocha coimpléisc próitéine a chumasú trí úsáid a bhaint as LC-MS/MS, ní mór dúinn ar dtús a chinneadh cé na haimínaigéid a athraítear agus mais deilt na lipéid taiscéalaithe.Tuairiscíodh meitiainín, histidine, tryptophan agus tyrosine a mhodhnú le ocsaigin singlet14,15.Comhtháthaimid sreabhadh oibre TOP-ABPP31 leis an gcuardach oscailte neamhchlaonta a sholáthraíonn ardán ríomhaireachta FragPipe bunaithe ar MSFragger32.Tar éis modhnú ocsaigine singlet agus lipéadú taiscéalaithe ceimiceacha, rinneadh clic-cheimic trí úsáid a bhaint as lipéad laghdaithe biotin a raibh nascóir insroichte ann, ina dhiaidh sin síneadh neutravidin agus díleá trypsin.Rinneadh an peiptíd modhnaithe, atá fós ceangailte leis an roisín, a fhótach-ghlanadh le haghaidh anailíse LC-MS/MS (Fíor 2a agus Sonraí Forlíontacha 1).Rinneadh líon mór modhnuithe ar fud an phróitéamaigh le breis agus 50 meaitseáil léarscáile peptide (PSM) liostaithe (Fíor 2b).Is ionadh é, níor thugamar faoi deara ach modhnú histidine, is dócha mar gheall ar imoibríocht níos airde histidine ocsaídithe i dtreo tóireadóirí ainilín ná aimínaigéid eile.De réir mheicníocht foilsithe ocsaídiúcháin histidine trí ocsaigin singlet,21,33 comhfhreagraíonn an struchtúr deilt-mhaise atá beartaithe de +229 Da do adduct probe 3 le 2-oxo-histidine tar éis dhá ocsaídiú, agus is é +247 Da an táirge hidrealú. de +229 Da (Fig. Forlíontach 5).Léiríodh sa mheastóireacht ar speictream MS2 ard-iontaofacht maidir le haithint fhormhór na n-ian y agus b, lena n-áirítear sainaithint iain bhlúire modhnaithe (y agus b) (Fíor 2c).Nocht anailís comhthéacs ar an seicheamh áitiúil de histidiní modhnaithe PDPL rogha measartha móitíf d'iarmhair hidreafóbach beag ag ±1 suímh (Fíor Forlíontach 4b).Ar an meán, aithníodh 1.4 histidine in aghaidh an phróitéin, agus socraíodh suíomhanna na marcóirí seo trí achar dromchla inrochtana ar thuaslagóirí (SASA) agus anailís ar infhaighteacht tuaslagóirí coibhneasta (RSA) (Fíor Fhorlíontach 4c,d).
Sreabhadh oibre neamhchlaonta chun staidéar a dhéanamh ar roghnaíocht iarmharach ag baint úsáide as an ardán ríomhaireachta FragPipe faoi thiomáint ag MSFragger.Úsáidtear nascóirí inscortha i gceimic Cliceáil chun fótaghréachtú peiptídí modhnaithe a cheadú ó roisín streiptídín.Seoladh cuardach oscailte chun an iliomad modhnuithe a shainaithint, chomh maith le hiarsmaí ábhartha.b Sann mais na modhnuithe a tharlaíonn ar fud an phrótóim.Léarscáiliú peptide PSM.c MS2 nóta speictreach ar shuíomhanna histidine modhnaithe le taiscéalaí 3. Mar shampla ionadaíoch, chuir imoibriú comhfhiúsach le taiscéalaí 3 +229.0938 Da leis an aimínaigéad modhnaithe.d Measúnacht sóchán a úsáidtear chun marcóirí PDPL a thástáil.Aistríodh PRDX3 (H155A, H225A) agus PRDX1 (H10A, H81A, H169A) le plasmid de chineál fiáin chun frith-Bhratach a bhrath.e Imoibríodh an peptíd shintéiseach le miniSOG íonaithe i láthair probe 3 agus tugadh faoi deara na táirgí comhfhreagracha le Δm +247 agus +229 sa speictream LC-MS.f Idirghníomhartha próitéine-go-próitéin in vitro atá múnlaithe le hantasubstaint miniSOG-6xHis-His agus anti-6xHis.Antaibheathaigh (streptavidin-HRP) agus anailís frith-luch blot an Iarthair ar choimpléisc antashubstainte miniSOG-6xHis/frith-6xHis lipéadaithe le taiscéalaí 3, ag brath ar an am a nochtar don solas.Cuirtear lipéid le haghaidh próitéiní aonair in iúl sa mheáchan móilíneach comhfhreagrach: slabhra solais antashubstaint LC, slabhra trom antashubstaint HC.Rinneadh na turgnaimh seo arís go neamhspleách ar a laghad dhá uair le torthaí comhchosúla.
Le haghaidh fíorú bithcheimiceach ar an suíomh lipéadaithe, athraíodh PRDX3 agus PRDX1 arna sainaithint ag mais-speictriméadracht ó histidine go alanín agus i gcomparáid le cineál fiáin i dtástálacha aistrithe.Léirigh torthaí PDPL gur laghdaigh an sóchán go mór an lipéadú (Fíor 2d).Idir an dá linn, rinneadh na seichimh peptide a aithníodh sa chuardach oscailte a shintéisiú agus a imoibriú in vitro le miniSOG íonaithe i láthair taiscéalaí 3 agus solas gorm, ag tabhairt táirgí le mais-aistriú de +247 agus +229 Da nuair a bhraith LC-MS (Fíor .2e).).Chun tástáil a dhéanamh an bhféadfaí próitéiní cóngaracha idirghníomhaithe a lipéadú in vitro mar fhreagra ar fhótaghníomhaíocht miniSOG, dhearamar measúnacht ghaireacht shaorga trí idirghníomhú idir an próitéin miniSOG-6xHis agus antashubstaint mhonaclónach in vitro frith-A (Fíor 2f).Sa mheasúnacht seo, bhíomar ag súil le lipéadú cóngarach ar slabhraí troma agus éadroma antashubstainte le miniSOG.Go deimhin, léirigh frith-luch (ag aithint slabhraí troma agus éadroma antasubstainte frith-6xHis-lipéadaithe) agus blotaí streptavidin an Iarthair biotinylation láidir ar na slabhraí troma agus éadroma.Go háirithe, thugamar faoi deara autobiotinylation miniSOG mar gheall ar an chlib 6xHis agus tras-naisc idir slabhraí éadrom agus trom, a d'fhéadfadh a bheith bainteach leis an bhearna cur síos roimhe seo idir lísín agus freagra proximal 2-oxo-histidine.Mar fhocal scoir, tagaimid ar an gconclúid go n-athraíonn PDPL histidine ar bhealach a bhraitheann ar a ghaireacht.
Ba é an chéad sprioc eile a bhí againn ná an próitéamaí fo-cheallacha a thréithriú chun sainiúlacht an lipéadaithe in situ a thástáil.Dá bhrí sin, chuireamar in iúl go cobhsaí miniSOG sa núicléas, maitrís mitochondrial, nó membrane ER seachtrach de chealla HEK293T (Fíor 3a).Léirigh anailís fhluaraiseachta glóthach go raibh go leor bannaí lipéadaithe ag trí shuíomh fo-cheallacha chomh maith le patrúin lipéadaithe éagsúla (Fíor 3b).Léirigh anailís íomháithe fhluaraiseachta sainiúlacht ard PDPL (Fíor 3c).Tar éis sreabhadh oibre PDPL bhí imoibrithe cliceáil le ruaimeanna rhodamine chun próitéamaí fo-cheallacha a shainmhíniú ag baint úsáide as micreascópacht fhluaraiseachta, agus comhlárnaíodh comharthaí PDPL le DAPI, rianaithe mitochondrial, nó rianaithe ER, ag dearbhú dílseacht ard PDPL.Maidir leis na trí shuíomh organelle, léirigh comparáid taobh le taobh de PDPL le TurboID ag baint úsáide as avidin western blot go raibh lipéadú níos sainiúla ar PDPL i gcomparáid lena rialuithe faoi seach.Faoi choinníollacha PDPL, bhí níos mó bannaí lipéadaithe le feiceáil, rud a léirigh níos mó próitéiní lipéadaithe PDPL (Fíor Forlíontach 6a-d).
Léiriú scéimreach ar lipéadú próitéamaí orgánail-idirghabhála mion-SOG.Díríonn miniSOG an maitrís mitochondrial trí chomhleá chuig an N-críochfort 23 aimínaigéid de COX4 daonna (mito-miniSOG), an núicléas trí chomhleá go H2B (núicléas-miniSOG), agus Sec61β tríd an taobh cíteaplasma den membrane ER (ER-miniSOG). ).I measc na tásca tá íomháú glóthach, íomháú comhfócach, agus mais-speictriméadracht.b Íomhánna glóthacha ionadaíocha de thrí phróifíl PDPL a bhaineann go sonrach le horgán.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Íomhánna comhfhócasacha ionadaíocha de chealla HEK293T ag cur miniSOG in iúl go seasta le logánaithe fo-cheallacha éagsúla arna bhrath ag antashubstaint lipéadaithe V5 (dearg).Úsáidtear marcóirí subcellular le haghaidh mitochondria agus ER (glas).Áiríonn sreabhadh oibre PDPL braite próitéamaí fo-cheallacha lipéadaithe miniSOG (buí) ag baint úsáide as ceimic cliceáil Cy3-azide.Barra scála: 10 µm.d Ceapacha bolcánacha de phróitéamaí a bhfuil clib PDPL orthu in orgánail éagsúla arna gcainníochtú trí chainníochtú neamhlipéadaithe (n = 3 thurgnamh bitheolaíoch neamhspleách).Baineadh úsáid as tástáil t dhá eireaball an Mhic Léinn ar cheapacha bolcáin.Baineadh úsáid as cineál fiáin HEK293T mar rialú diúltach. Aibhsítear próitéiní atá athraithe go suntasach i ndath dearg (p < 0.05 agus> difríocht déine ian 2-huaire). Aibhsítear próitéiní atá athraithe go suntasach i ndath dearg (p < 0.05 agus> difríocht déine ian 2-huaire). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 agus >2-кратная разница в интенсивности). Aibhsítear próitéiní atá athraithe go suntasach i ndath dearg (p < 0.05 agus > difríocht faoi dhó i ndéine ian).lch < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионнеой сил). Aibhsítear próitéiní atá athraithe go suntasach i ndath dearg (p <0.05 agus> difríocht faoi dhó i neart ianach).Taispeántar próitéiní gaolmhara atá tábhachtach do HEK293T-miniSOG ach nach bhfuil tábhachtach do HEK293T i glas.e Anailís ar shainiúlacht na dtacar sonraí próitéamacha ó thurgnaimh d.Tá líon iomlán na bpróitéiní atá suntasach go staitistiúil i ngach organelle (ponc dearg agus glas) marcáilte ag an mbarr.Léiríonn histeagraim próitéiní logánta in orgánaigh bunaithe ar MitoCarta 3.0, anailís GO agus A. Ting et al.daoine.Tacar sonraí ar leith le haghaidh mitochondria, núicléas, agus ER.Rinneadh na turgnaimh seo arís go neamhspleách ar a laghad dhá uair le torthaí comhchosúla.Cuirtear sonraí amh ar fáil i bhfoirm comhaid sonraí amh.
Spreagtha ag na torthaí glóthacha agus íomháithe, baineadh úsáid as cainníochtú gan lipéad chun an próitéamaí sainaitheanta i ngach orgánail a chainníochtú (Sonraí Forlíontacha 2).Baineadh úsáid as HEK293T neamhaistrithe mar rialú diúltach chun marcóirí cúlra a dhealú. Léirigh anailís ar phlota bolcáin próitéiní saibhrithe go suntasach (p < 0.05 agus > déine ian 2-huaire) chomh maith le próitéiní singil nach bhfuil i láthair ach i línte mionsOG-léirithe (Fíor 3d poncanna dearga agus glasa). Léirigh anailís ar phlota bolcáin próitéiní saibhrithe go suntasach (p < 0.05 agus > déine ian 2-huaire) chomh maith le próitéiní singil nach bhfuil i láthair ach i línte mionsOG-léirithe (Fíor 3d poncanna dearga agus glasa). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Léirigh anailís ar phlota bolcán próitéiní saibhrithe go suntasach (p<0.05 agus>2-huaire déine ian) chomh maith le próitéiní aonair nach bhfuil i láthair ach amháin i línte miniSOG-léirithe (Fíor 3d, poncanna dearg agus glas).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 蛋白质 （（P <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 在于 在于 在于 在于 系 中 的 单一 蛋白质 （（图 3D 红色 和 绿色点）。。。。。。。。。火山图 分析 显示 出 显着 蛋白质 蛋白质 （（P <0.05 和> 2 倍 强度）） 仅 存 在于 在于 在于 在于 在于 在于 系 的 单一 （（图 图 图 图 图 红色 绿色点 。。。 。。。））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Nocht anailís ar phlota bolcáin próitéiní saibhrithe go suntasach (p<0.05 agus> 2x neart ianach) chomh maith le próitéiní aonair nach bhfuil i láthair ach sa líne slonn miniSOG (poncanna dearga agus glasa i bhFíor 3d).Agus na sonraí seo á gcomhcheangal againn, d'aithníomar 1364, 461, agus 911 próitéiní membrane seachtracha, mitochondrial agus ER a bhí suntasach go staitistiúil, faoi seach.Chun anailís a dhéanamh ar chruinneas PDPL organelle-logánta, d'úsáideamar MitoCarta 3.0, anailís Gene Ontology (GO), agus A. Ting et al.Baineadh úsáid as tacar sonraí8 le haghaidh mitochondria, núicléas, agus ER chun sainiúlacht organelle na próitéiní braite a thástáil, a fhreagraíonn do chruinneas 73.4, 78.5, agus 73.0% (Fíor 3e).Deimhníonn sainiúlacht PDPL gur uirlis iontach é PDPL chun próitéamaí orgánail-shonracha a shainaithint.Go háirithe, léirigh anailís submitochondrial ar phróitéiní mitochondrial aitheanta go raibh an próitéamaí gafa scaipthe go príomha sa mhaitrís agus sa membrane istigh (226 agus 106, faoi seach), ag cuntasaíocht do 91.7% (362) de líon iomlán na bpróitéiní mitochondrial aitheanta.deimhníodh leibhéal ard PDPL freisin (Fíor Forlíontach 7a).Mar an gcéanna, léirigh anailís subnuclear go raibh an proteome a gabhadh dáileadh go príomha sa núicléas, nucleoplasm, agus nucleolus (Fíor Forlíontach. 7b).Anailís próitéamaíche núicléach le peptide comhartha logánú núicléach (3xNLS) léirigh cruinneas cosúil leis an H2B thógáil (Fíor Forlíontach. 7c-h).Chun sainiúlacht an mharcóra PDPL a chinneadh, roghnaíodh laminín núicléach A mar ghaiste POI7 níos scoite i gceart.D'aithin PDPL 36 próitéin saibhrithe go suntasach, a raibh próitéiní 12 (30.0% lena n-áirítear lamin A) ina bpróitéiní idirghníomhaithe lamin A dea-charachtar agus anótáilte ag an mbunachar sonraí Teaghrán, le céatadán níos airde ná an modh BioID (próitéiní 122) 28 de 28. , 22.9 %) 7. D'aithin ár modh níos lú próitéiní, b'fhéidir mar gheall ar réimsí teoranta lipéadaithe, rud a d'fhéadfadh a bheith ann de bharr ocsaigine singil níos gníomhaí.Léirigh anailís GO go raibh na próitéiní aitheanta lonnaithe go príomha sa nucleoplasm (26), membrane núicléach (10), membrane núicléach (9), agus pores núicléacha (5).I dteannta a chéile, b'ionann na próitéiní núicléacha-áitithe seo agus 80% de na próitéiní saibhrithe, rud a léiríonn níos mó sainiúlacht PDPL (Fíor Forlíontach 8a-d).
Tar éis dúinn cumas PDPL a bhunú chun marcáil gaireachta a dhéanamh in organelles, rinneamar tástáil ansin an bhféadfaí PDPL a úsáid chun anailís a dhéanamh ar chomhpháirtithe ceangailteacha POI.Go háirithe, rinneamar iarracht anailís PDPL ar phróitéiní citosólacha a shainiú, a meastar a bheith ina spriocanna níos deacra ná a gcomhghleacaithe membrane-logánta mar gheall ar a nádúr an-dinimiciúil.Mheall an próitéin bromodomain agus extraterminal (BET) BRD4 ár n-aird mar gheall ar a phríomhról i galair éagsúla 35, 36 .Tá an coimpléasc atá déanta ag BRD4 ina chomhghníomhaitheoir tras-scríobhach agus ina sprioc teiripeach tábhachtach.Trí léiriú fachtóirí trascríobh c-myc agus Wnt5a a rialú, meastar go bhfuil BRD4 ina phríomhchinntitheach ar leoicéime myeloid ghéarmhíochaine (AML), miolóma iolrach, liomfóma Burkitt, ailse drólainne agus galair athlastacha37,38.Ina theannta sin, díríonn roinnt víris ar BRD4 chun tras-scríobh víreasach agus ceallach a rialáil, mar an víreas papilloma, VEID, agus SARS-CoV-236,39.
Chun an idirghníomhaíocht BRD4 a mhapáil ag baint úsáide as PDPL, chomhcheangail muid miniSOG le isoform gearr N- nó C-críochfort BRD4.Léirigh torthaí próitéamacha leibhéal ard forluí idir an dá thógáil (Fig. Forlíontach 9a).Clúdaíonn an proteome núicléach a aithníodh le miniSOG-H2B 77.6% de na próitéiní a idirghníomhaíonn le BRD4 (Fíor Forlíontach 9b).Ansin, úsáideadh amanna éagsúla soilsithe (2, 5, 10, 20 min) chun an ga marcála a choigeartú (Fíor 4a agus sonraí forlíontacha 3).Bainimid de thátal as, ag fóta-thréimhsí níos giorra, go ndéanfaidh PDPL lipéadú go príomha ar chomhpháirtithe ceangailteacha díreacha, agus go n-áireoidh tréimhsí níos faide próitéiní a shainaithnítear le linn tréimhsí fótaghníomhaithe níos giorra chomh maith le spriocanna indíreacha i gcoimpléisc lipéadaithe.Go deimhin, fuair muid forluí láidir idir pointí ama cóngarach (84.6% ar feadh 2 agus 5 nóiméad; 87.7% ar feadh 5 agus 10 nóiméad; 98.7% ar feadh 10 agus 20 nóiméad) (Fíor 4b agus Fíor Forlíontach. 9c).I ngach grúpa turgnamhach, fuaireamar ní hamháin féinlipéadú BRD4, ach bhí roinnt spriocanna aitheanta mar MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, agus HMGB1 anótáilte sa bhunachar sonraí teaghrán.Tá neart ianach na spriocanna seo comhréireach leis an am nochta (Fíor 4c agus Fíor Forlíontach 9d).Léirigh anailís GO ar na próitéiní a aithníodh sa ghrúpa 2 nóiméad go raibh na próitéiní sainaitheanta logánaithe sa núicléas agus go raibh baint acu le hathmhúnlú crómatin agus feidhm RNA polymerase.Saibhríodh feidhm mhóilíneach an phróitéin i gceangal crómatin nó i gcomhghníomhú trasscríofa, ag teacht le feidhm BRD4 (Fíor 4d).Nocht anailís idirghníomhaíocht próitéine ar chumas bunachar sonraí teaghrán an chéad leibhéal d'idirghníomhaíochtaí indíreacha idir coimpléisc idirghníomhaithe teaghlaigh BRD4 agus HDAC mar SIN3A, NCOR2, BCOR, agus SAP130 (Fíor 4e agus Fíor Fhorlíontach. 9e), comhsheasmhach le histones aicéitilithe ceangailteach BRD4 agus HDAC. ..Ina theannta sin, dheimhnigh blotáil an Iarthair spriocanna ionadaíocha arna sainaithint ag LC-MS/MS, lena n-áirítear Sin3A, NSUN2, Fus, agus SFPQ (Fíor 4f).Le déanaí, tuairiscíodh gur foirm ghearr isoform BRD4 núicléis a bhfuil airíonna deighilte chéim leachtach-leachtach (LLPS).Déanann na próitéiní ceangailteacha RNA Fus agus SFPQ idirghabháil ar LLPS na bpróiseas ceallacha éagsúla agus sainaithníodh anseo iad mar phróitéiní ceangailteacha BRD4 neamhthaifeadta.Deimhníodh an t-idirghníomhú idir BRD4 agus SFPQ le turgnaimh chomh-imdhíonachta (comh-IP) (Fíor 4g), rud a mhol meicníocht eile le haghaidh scaradh céime leacht-leacht-idirghabhála BRD4 ar fiú imscrúdú breise a dhéanamh air.Le chéile, tugann na torthaí seo le fios gur ardán idéalach é PDPL chun idirghníomhú BRD4 ar a dtugtar a aithint chomh maith le próitéiní ceangailteach anaithnid.
Léiriú scéimreach de mharcáil gaireachta BRD4 mion-idirghabhálaithe SOG, amanna nochta: 2, 5, 10, agus 20 nóim.b Forluí próitéiní aitheanta ag amanna soilsithe éagsúla.Bhí an saibhriú próitéine a aithníodh i HEK293T-miniSOG-BRD4 suntasach go staitistiúil i gcomparáid le cineál fiáin HEK293T.c Déine an iain agus próitéiní ionadaíocha neamhlipéadaithe aitheanta atá ceangailteach BRD4 á chainníochtú le linn an ama nochta sonraithe.n = 3 shampla atá neamhspleách go bitheolaíoch.Cuirtear sonraí i láthair mar mheán ± diall caighdeánach.d Anailís ontologach géine (GO) ar phróitéiní a aithníodh sa ghrúpa 2 nóiméad.Tá na chéad deich dtéarma GO liostaithe.Tá boilgeoga daite de réir chatagóir téarma GO, agus tá méid mboilgeog comhréireach le líon na próitéiní a fhaightear i ngach téarma.e Anailís teaghrán ar phróitéiní a idirghníomhaíonn le BRD4.Is gliú díreach iad na ciorcail buí agus is iad na ciorcail liath an chéad sraith de gliú indíreach.Léiríonn na línte dearga na hidirghníomhaíochtaí arna gcinneadh go turgnamhach agus seasann na línte gorma do na hidirghníomhaíochtaí tuartha.f Fíoraíodh spriocanna ceangailteacha ionadaíocha BRD4 a aithníodh in LC-MS/MS le blotting an Iarthair.g Deimhníonn turgnaimh chomh-imdhíon-fhuascailt an idirghníomhaíocht idir SFPQ agus BRD4.Rinneadh na turgnaimh seo arís go neamhspleách ar a laghad dhá uair le torthaí comhchosúla.Cuirtear sonraí amh ar fáil i bhfoirm comhaid sonraí amh.
Chomh maith le spriocanna neamhchláraithe a bhaineann le POI a shainaithint, ní mór dúinn hipitéis a thabhairt go mbeidh PDPL oiriúnach chun foshraitheanna a aithint d’einsímí, rud a d’éileodh tréithriú próitéiní ceangailteacha indíreacha i gcoimpléisc mhóra chun foshraitheanna neamhchláraithe a anótáil.Is ligáis E3 é Parkin (ionchódaithe ag PARK2) agus is eol go mbíonn galar Parkinson ógánach cúlaitheach uathshómach (AR-JP)42 mar thoradh ar shócháin i parkin.Ina theannta sin, tá cur síos déanta ar parkin mar rud riachtanach le haghaidh mitophagy (autophagy mitochondrial) agus deireadh a chur le speicis ocsaigin imoibríoch.Mar sin féin, cé gur aithníodh roinnt foshraitheanna parkin, níl ról parkin sa ghalar seo soiléir fós.Chun a fhoshraitheanna neamhthréithrithe a anótáil, rinneadh tástáil ar PDPL trí miniSOG a chur leis an gcríochfort N- nó C de parkin.Cóireáladh cealla leis an iompróir prótón carbóinile ciainíde m-chlorophenylhydrazone (CCCP) chun parkin a ghníomhachtú tríd an gcosán PINK1-Parkin.I gcomparáid lenár dtorthaí BRD4 PDPL, léirigh comhleá N-terminus parkin sraith níos mó de spriocphróitéiní, cé gur chlúdaigh sé cuid níos mó den C-críochfort (177 as 210) (Fíor 5a,b agus Sonraí Forlíontacha 4).tá an toradh comhsheasmhach le tuairiscí gur féidir le clibeanna N-críochfoirt Parkin44 a ghníomhachtú go héagsúil.Is ionadh é, ní raibh ach 18 próitéin forluiteach inár sonraí le torthaí AP-MS foilsithe do Parkin43, is dócha mar gheall ar dhifríochtaí idir línte cille agus sreafaí oibre próitéamaíochta.Chomh maith le ceithre phróitéin aitheanta (ARDM1, HSPA8, PSMD14, agus PSMC3) arna sainaithint trí dhá mhodh (Fíor 5c)43.Chun torthaí LC-MS/MS a bhailíochtú tuilleadh, baineadh úsáid as cóireáil PDPL agus blotting an Iarthair ina dhiaidh sin chun comparáid a dhéanamh idir torthaí mheasúnacht tuismitheora HEK293T agus an líne pháirceála N-críochfort cobhsaí.Rinneadh tástáil ar spriocanna anaithnide roimhe seo CDK2, DUT, CTBP1, agus PSMC4 le ceanglóra aitheanta, DNAJB1 (Fíor 5d).
Plota bolcán de phróitéiní idirghníomhaithe parkin i gcealla HEK293T le miniSOG sainráite go cobhsaí comhleádh leis an N- nó C-críochfort parkin (n = 3 turgnaimh bitheolaíocha neamhspleácha).Baineadh úsáid as tástáil t dhá eireaball an Mhic Léinn ar cheapacha bolcáin.Baineadh úsáid as HEK293T mar rialú diúltach. Aibhsítear próitéiní atá athraithe go suntasach i ndath dearg (p < 0.05 agus> difríocht déine ian 2-huaire). Aibhsítear próitéiní atá athraithe go suntasach i ndath dearg (p < 0.05 agus> difríocht déine ian 2-huaire). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 agus >2-кратная разница в интенсивности). Aibhsítear próitéiní atá athraithe go suntasach i ndath dearg (p < 0.05 agus > difríocht faoi dhó i ndéine ian).lch < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионнеой сил). Aibhsítear próitéiní atá athraithe go suntasach i ndath dearg (p <0.05 agus> difríocht faoi dhó i neart ianach).Taispeántar próitéiní gaolmhara atá tábhachtach do HEK293T-miniSOG ach nach bhfuil tábhachtach do HEK293T i glas.b Léaráid Venn a thaispeánann próitéiní forluiteacha idir tógálacha N-teirminéal agus C-críochfort.Is féidir le clibeanna N-críochfoirt parkin a ghníomhachtú go beacht agus próitéiní níos so-aitheanta a bheith mar thoradh orthu.c Léaráid Venn a thaispeánann próitéiní forluiteacha idir PDPL agus AP-MS.Tá idirghníomhaíochtaí aitheanta liostaithe, lena n-áirítear 4 de 18 próitéin fhorluiteacha agus 11 de 159 próitéin a shainaithnítear go sonrach i PDPL.d Fíoraíodh spriocanna ionadaíocha arna sainaithint ag LC-MS/MS le blotting an Iarthair.e Aithníodh ssu72 agus SNW1 mar fhoshraitheanna parkin neamhchláraithe.Aistríodh na plasmid próitéine seo a bhfuil clib FLAG orthu go HEK293T agus HEK293T-Parkin-miniSOG agus ina dhiaidh cóireáil CCCP ag pointí ama éagsúla.Bhí an díghrádú níos suntasaí i líne overexpression Parkin.f Agus an t-inhibitor proteasome MG132 á úsáid, deimhníodh go ndéantar an próiseas díghrádaithe Ssu72 agus SNW1 a idirghabháil le proteasome-ubiquitination.Rinneadh na turgnaimh seo arís go neamhspleách ar a laghad dhá uair le torthaí comhchosúla.Cuirtear sonraí amh ar fáil i bhfoirm comhaid sonraí amh.
Go háirithe, ní mór próitéiní atá ceangailteach páirce agus a bhfoshraitheanna a áireamh sna próitéiní a shainaithníonn PDPL.Chun foshraitheanna parkin neamhchláraithe a bhrath, roghnaigh muid seacht bpróitéin aitheanta (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 agus SNW1) agus plasmid a aistríodh chun na géinte seo a nochtadh do ghnáth-HEK293T agus chun cóireáil HEK293T miniSOG-Parkin a chur in iúl go seasta agus cóireáil CCCP ina dhiaidh sin.Laghdaíodh leibhéil próitéiní Ssu72 agus SNW1 go suntasach i líne cobhsaí miniSOG-Parkin (Fíor 5e).Mar thoradh ar chóireáil le CCCP ar feadh 12 uair an chloig bhí an díghrádú is suntasaí ar an dá fhoshraith.Chun imscrúdú a dhéanamh an bhfuil díghrádú Ssu72 agus SNW1 á rialú ag proteasome-ubiquitination, cuireadh an t-inhibitor proteasome MG132 leis chun gníomhaíocht proteasome a chosc, agus go deimhin fuaireamar amach go raibh bac ar a bpróiseas díghrádaithe (Fíor 5f).Deimhníodh spriocanna breise neamhfhoshraith mar idirghníomhaithe Parkin ag baint úsáide as blotting an Iarthair (Fíor Forlíontach 10), a léirigh torthaí comhsheasmhach le LC-MS/MS.Mar fhocal scoir, ceadaíonn comhtháthú sreabhadh oibre PDPL le fíorú aistrithe próitéine sprice foshraitheanna ligáis E3 neamhchláraithe a aithint.
D’fhorbraíomar ardán marcála cóngarachta a ligeann duit POIs idirghníomhaithe i spás agus in am a aithint.Tá an t-ardán bunaithe ar phróitéin photosensitizer miniSOG, nach bhfuil ach thart ar 12 kDa, níos lú ná leath mhéid an einsím aibí APEX2 (27 kDa) agus aon trian de mhéid TurboID (35 kDa).Ba cheart go gcuirfeadh an méid níos lú go mór le raon na n-iarratas chun staidéar a dhéanamh ar idirghníomhú próitéine beag.Tá gá le tuilleadh taiscéalaíochta a dhéanamh ar fhótaisintitheoirí breise, cibé acu próitéiní géiniteacha ionchódaithe nó móilíní beaga, chun táirgeacht chandamach ocsaigine singil a mhéadú agus íogaireacht an chur chuige seo a leathnú.Maidir leis an leagan reatha de miniSOG, is féidir ardtaifeach ama a bhaint amach trí úsáid a bhaint as soilsiú gorm chun marcóirí gaireachta a ghníomhachtú.Ina theannta sin, d'eisigh am nochta níos faide “scamall” níos mó d'ocsaigin singlet, rud a d'fhág gur modhnaíodh níos mó iarmhair histidine distal, ga lipéadaithe méadaithe, agus an cumas chun an taifeach spásúil PDPL a mhionchoigeartú.Rinneamar tástáil freisin ar sheacht dtóir cheimiceacha chun an cóimheas comhartha-go-cúlra a mhéadú agus rinneamar iniúchadh ar an meicníocht mhóilíneach taobh thiar den chur chuige seo.Dhearbhaigh sreabhadh oibre TOP-ABPP in éineacht le cuardach oscailte neamhchlaonta nár tharla modhnuithe ach amháin ar histidine agus níor breathnaíodh aon mhicrithimpeallacht comhsheasmhach le haghaidh modhnuithe méadaithe histidine, ach amháin rogha measartha do histidine sa réigiún lúb.
Baineadh úsáid as PDPL freisin chun próitéamaí fo-cheallacha a shaintréithe a bhfuil sainiúlacht agus clúdach próitéam acu atá inchomparáide ar a laghad le lipéadú gaireachta eile agus modhanna taiscéalaithe ceimiceacha orgánail-shonracha.Baineadh úsáid rathúil freisin as marcóirí cóngarachta chun na próitéamaí dromchla, líseasómacha agus rúnda46,47 a shaintréithe.Creidimid go mbeidh PDPL comhoiriúnach leis na horgánaigh fho-cheallacha seo.Ina theannta sin, thugamar dúshlán do PDPL trí spriocanna a aithint do cheangal próitéin chitosólach atá níos casta ná próitéiní atá ceangailte le membrane mar gheall ar a n-airíonna dinimiciúla agus a rannpháirtíocht in idirghníomhaíochtaí níos ama.Cuireadh PDPL i bhfeidhm ar dhá phróitéin, an comhghníomhaí trascríobh BRD4 agus an ligáis E3 Parkin a bhaineann le galair.Roghnaíodh an dá phróitéin seo ní hamháin as a gcuid feidhmeanna bunúsacha bitheolaíocha, ach freisin as a n-ábharthacht chliniciúil agus a n-acmhainneacht theiripeach.I gcás an dá POI seo, sainaithníodh comhpháirtithe ceangailteacha aitheanta mar aon le spriocanna neamhchláraithe.Go háirithe, dheimhnigh co-IP an próitéin a bhaineann le scaradh céime SFPQ, rud a d'fhéadfadh meicníocht nua a léiriú trína rialaíonn BRD4 (isoform gearr) LLPS.Ag an am céanna, creidimid gur cás é aithint foshraitheanna Parkin ina bhfuil gá le greamacháin indíreacha a aithint.D'aithníomar dhá fhoshraith pháircín neamhaitheanta agus dheimhnigh muid a ndíghrádú feadh an chosáin uileláithreachta-próitéasóim.Le déanaí, forbraíodh straitéis gaiste bunaithe ar mheicníocht chun foshraitheanna hidrealaáis a bhrath trí einsímí a ghaistiú.Cé gur modh an-chumhachtach é seo, níl sé oiriúnach chun anailís a dhéanamh ar fhoshraitheanna a bhfuil baint acu le foirmiú coimpléisc mhóra agus éilíonn sé bannaí comhfhiúsacha a fhoirmiú idir an einsím agus an tsubstráit.Táimid ag súil go bhféadfar PDPL a leathnú chun staidéar a dhéanamh ar choimpléisc próitéine eile agus ar theaghlaigh einsíme, mar shampla na teaghlaigh deubiquitinase agus metalloprotease.
Forbraíodh foirm nua miniSOG, ar a dtugtar SOPP3, le táirgeadh ocsaigine singlet feabhsaithe.Rinneamar comparáid idir miniSOG agus SOPP3 agus fuaireamar feabhas ar fheidhmíocht mharcála, cé gur fhan an cóimheas comhartha-go-torann gan athrú (Fíor Forlíontach 11).Rinneamar hipitéisiú go dtiocfadh leas iomlán a bhaint as SOPP3 (m.sh., trí éabhlóid faoi threoir) go dtiocfadh próitéiní photosensitizer níos éifeachtaí a éilíonn amanna solais níos giorra agus dá bhrí sin go bhféadfaí próisis cheallacha níos dinimiciúla a ghabháil.Go háirithe, tá an leagan reatha de PDPL teoranta don timpeallacht cheallacha toisc go dteastaíonn soilsiú gorm uaidh agus ní féidir leis dul i bhfód ar fhíocháin dhomhain.Cuireann an ghné seo cosc ​​ar a úsáid i staidéir mhúnla ainmhithe.Mar sin féin, d'fhéadfadh an teaglaim de optogenetics le PDPL deis a sholáthar do thaighde ainmhithe, go háirithe san inchinn.Ina theannta sin, baineann fóta-íogairí infridhearg innealtóireacht eile an teorainn seo freisin.Tá taighde ar siúl sa réimse seo faoi láthair.
Fuarthas an líne cille HEK293T ó ATCC (CRL-3216).Thástáil an líne cille diúltach le haghaidh ionfhabhtú mycoplasma agus saothraíodh é i DMEM (Thermo, #C11995500BT) agus forlíonta le séiream bó-ainmhithe féatais 10% (FBS, Vistech, #SE100-B) agus 1% peinicillin/streiptimícin (Hiclone, #SV30010).tar éis fás i.
Ceannaíodh 3-Aminophenylene (sampla 3) agus (4-ethynylphenyl)methanamine (sampla 4) ó Bidepharm.Ceannaíodh próipilimín (probe 2) ó Energy-chemicals.Rinneadh N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) a shintéisiú de réir modhanna foilsithe.
Liostaíonn Tábla Forlíontach 1 na tógálacha géiniteacha a úsáideadh sa staidéar seo.Clónáladh na seichimh miniSOG agus KillerRed ó plasmid bronntanais ó P. Zou (Ollscoil Peking).Díorthaíodh an seicheamh spriocdhírithe maitrís mitochondrial ó na 23 aimínaigéid N-críochfort de COX4 agus clónáilte isteach sna veicteoirí léirithe ag baint úsáide as tionól Gibson (Beyotime, # D7010S).Chun díriú ar membrane agus núicléas an reticulum endoplasmic, SEC61B DNA daonna (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) méadaithe ag PCR ó leabharlann cDNA de chealla HEK293T, agus H2B DNA (deonaithe ag D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) agus clónáilte , mar a luadh thuas .Mura gcuirtear a mhalairt in iúl, méadaíodh PCR ar ghéinte próitéine eile a úsáideadh le haghaidh aistriú agus tógáil línte cille cobhsaí ó leabharlann cDNA cealla HEK293T.Baineadh úsáid as G3S (GGGS) agus G4S (GGGGS) mar nascóirí idir an próitéin bhaoite agus miniSOG.Cuireadh clib epitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) leis na tógálacha comhleá seo.Le cur in iúl i mamaigh agus chun líne cille chobhsaí a bhunú, rinneadh fochlónáil ar an gcomhleá miniSOG isteach sa veicteoir lentiviral pLX304.Le haghaidh léiriú baictéarach, rinneadh miniSOG a chlónáil isteach sa veicteoir pET21a lipéadaithe 6xHis ag an gcríochfort C.
Síolaíodh cealla HEK293T ag cealla 2.0 x 105 in aghaidh an tobair i bplátaí sé-tobair agus aistríodh iad 24 uair an chloig ina dhiaidh sin le plasmidí lentiviral athchuingreach (2.4 μg pLX304) agus plasmidí pacáistithe víreasacha (1.5 μg psPAX2 agus 1.2 μg pMD). , #C0533), thart ar 80% comhleá.Tar éis aistriú thar oíche, athraíodh an meán agus gor é ar feadh 24 uair an chloig eile.Rinneadh bailiú an víris tar éis 24, 48 agus 72 uair an chloig.Roimh ionfhabhtú na sprioclínte cille, rinneadh an meán víreasach a scagadh trí scagaire 0.8 μm (Merck, #millex-GP) agus cuireadh polybrene (Solarbio, #H8761) le tiúchan 8 μg/ml.Tar éis 24 uair an chloig, ceadaíodh na cealla a ghnóthú trí mheán a athrú.Roghnaíodh cealla ag baint úsáide as 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) don chéad trí sliocht mar rogha níos déine.Baineadh úsáid ansin as 20 µg/ml mar chóras níos déine do na trí sliocht eile.
Síolaíodh cealla i ndlísheomraí 12 thobar (Ibidi, #81201) ag dlús de thart ar 20,000 cill in aghaidh an tobair.Chun greamaitheacht cealla HEK293T a fheabhsú, cuir 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) caolaithe i saline maolánach fosfáit (PBS, Sangon, #B640435) ag 37 °C.Rinneadh na seomraí a réamhchóireáil ar feadh 1 uair agus ansin baineadh iad le PBS.Tar éis 24 h, nite cealla uair amháin le PBS, gortha le 1 mM taiscéalaí 3 i dtuaslagán salainn cothromaithe Hanks úr (HBSS, Gibco, #14025092) ar feadh 1 h ag 37 ° C, agus ansin gortha le stiúir gorm (460 nm). ).) ionradaithe ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra.Ina dhiaidh sin, nitear na cealla faoi dhó le PBS agus socraíodh iad le formaildéad 4% i PBS (Sangon, #E672002) ar feadh 15 nóiméad ag teocht an tseomra.Baineadh an iomarca formaildéad as cealla seasta trí níochán le PBS faoi thrí.Ansin tréscaoilteadh cealla le 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) i PBS agus nite 3 huaire le PBS.Ansin bain an seomra agus cuir le gach sampla 25 µl de mheascán imoibrithe cliceáil ina bhfuil 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) agus 0.5 mg/ml ascorbate sóidiam (Aladdin, uimh. S105024) agus gor ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra.Tar éis imoibriú snap, nite cealla sé huaire le PBS ina raibh 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) agus ansin bac le 5% BSA (Abcone, #B24726) i PBST ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra.
Maidir le colocalization imdhíonachta, goraíodh cealla le antasubstaintí príomhúla de réir na gcoinníollacha atá léirithe: luch frith-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), coinín frith-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), antasubstaint frith-chalnexin polachlónúil coinín (1:500, Abcam, #ab22595) nó antasubstaint mhonaclónach frith-laimin A/C coinín (1:500; CST, #2032) ag 4 °C thar oíche.Tar éis iad a ní 3 huaire le PBST, goraíodh cealla le antasubstaintí tánaisteacha: caolaithe frith-choine gabhar Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) 1:1000, frith-luch gabhar Alexa Fluor 594 (CST, #8889) caolaithe 1:1000.caolú Caolaigh ag teocht an tseomra ar feadh 30 nóiméad.Ansin nite cealla 3 huaire le PBST agus frithdhaite le DAPI (Thermo, #D1306) i PBS ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra.Tar éis 3 nite le PBS, séalaithe cealla i gliocról 50% (Sangon, #A600232) i PBS le haghaidh íomháithe.Fuarthas íomhánna imdhíonfluaraiseacha trí úsáid a bhaint as micreascóp comhfhócasach ZEISS LSM 900 Airyscan2 agus bogearraí ZNE 3.5.
Le haghaidh íomháithe fluaraiseacha ocsaigine singlet, nite cealla faoi dhó le maolán Hanks HEPES sular cuireadh 100 nM Si-DMA leis i maolán Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Tar éis nochtadh don solas, goradh na cealla i gorlann CO2 ag 37°C ar feadh 45 nóiméad.Ansin nite cealla faoi dhó le maolán HEPES Hanks agus frithdhaite le Hoechst i maolán HEPES Hanks ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra agus léirshamhlú ag baint úsáide as micreascóp comhfhócasach ZEISS LSM 900., #M36008) i maolán HBSS ina bhfuil cailciam agus maignéisiam.Tar éis nochtadh do solas nó doxorubicin (MCE, #HY-15142A), goradh cealla i gorlann CO2 ag 37 ° C. ar feadh 10 nóiméad, nite faoi dhó le maolán HBSS, agus goradh iad le Hoechst i maolán HBSS ag teocht an tseomra.nóiméad.Baineadh úsáid as Doxorubicin mar rialú probe dearfach nuair a déileáladh le cealla le 20 μM doxorubicin i HBSS ina raibh 1% BSA ar feadh 30 min.Fuarthas íomhánna imdhíonfluaraiseacha ag baint úsáide as micreascóp comhfhócasach Zeiss LSM 900.
Síolaíodh cealla HEK293T a léiríonn mito-miniSOG go cobhsaí ag dlús de thart ar 30% i miasa 15 cm.Tar éis 48 uair an chloig, nuair a thángthas ar chumar ~ 80%, nite na cealla uair amháin le PBS, gortha le 1 mM Probe 3 i maolán HBSS úr isteach ar feadh 1 uair ag 37 ° C agus ansin soilsithe le stiúir gorm ar feadh 10 nóiméad sa seomra. teocht..Ina dhiaidh sin, nite na cealla faoi dhó le PBS, scríobtha agus athchuireadh i maolán PBS fuar oighir ina raibh coscairí próitéáis saor ó EDTA (MCE, #HY-K0011).Bhí lysed cealla ag sonicating an rinn ar feadh 1 nóiméad (1 soicind ar aghaidh agus 1 dara uaire ag aimplitiúid 35%).Rinneadh an meascán a bhí mar thoradh air a lártheifneoiriú ag 15,871 xg ar feadh 10 nóiméad ag 4°C chun smionagar a bhaint, agus coigeartaíodh an tiúchan supernatant go 4 mg/mL ag baint úsáide as trealamh measúnaithe próitéin BCA (Beyotime, #P0009).Comhcheangail 1 ml den lysate thuas le 0.1 mM biotin azide fóta-dhíghrádaithe (Confluore, #BBBD-14), TCEP 1 mM (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), agus 1 mM CuSO4 gorlainne rothlú suas ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra.Tar éis imoibriú snap, cuir an meascán leis an tuaslagán réamh-mheasctha (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) i vial gloine 10 ml.Rinneadh na samplaí a mheascadh agus a lártheifneoiriú ag 4500 g ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra.Caitheadh ​​na tuaslagáin íochtair agus uachtaracha, nite an deascán faoi dhó le 1 ml meatánóil agus lártheifneoirithe ag 15871×g ar feadh 5 nóiméad ag 4°C.Cuir 1 ml de 8 M úiré (Aladdin, uimh. U111902) le décharbónáit amóiniam 25 mM (ABC, Aladdin, uimh. A110539) chun an deascán a thuaslagadh.Athdhéantar samplaí le 10 mM dithiotreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) ar feadh 40 nóiméad ag 55°C agus ina dhiaidh sin cuireadh 15 mM iaidín aicéatáitíd úr (Sangon, #A600539) ag teocht an tseomra sa dorchadas.Alkylation laistigh de 30 nóiméad..Cuireadh dithiotreitol 5 mM breise leis chun an t-imoibriú a stopadh.Ullmhaigh thart ar 100 µl coirníní agarose NeutrAvidin (Thermo, #29202) do gach sampla trí nite 3 huaire le 1 ml PBS.Caolaíodh an tuaslagán proteome thuas le 5 ml PBS agus é a ghoradh le coirníní agarose NeutrAvidin réamh-nite ar feadh 4 huaire ag teocht an tseomra.Ansin nitear na coirníní 3 huaire le 5 ml PBS ina raibh 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 huaire le 5 ml PBS ina raibh 1M úiré, agus 3 huaire le 5 ml ddH2O.Baineadh na coirníní ansin trí lártheifneoiriú agus athchuireadh iad i 200 μl de 25 mM ABC ina raibh 1 M úiré, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) agus 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinize thar oíche ag 37°C le rothlú.Stopadh an t-imoibriú trí aigéad formach (Thermo, # A117-50) a chur leis go dtí gur shroich an pH 2-3.Nitear na coirníní 3 huaire le 1 ml de PBS ina bhfuil 0.2% SDS, 3 huaire le 1 ml de PBS ina bhfuil 1 M úiré, agus ansin 3 huaire le 1 ml d'uisce driogtha.Scaoileadh na peptídí modhnaithe trí lysis éadrom (365 nm) ar feadh 90 nóiméad ag baint úsáide as 200 μl de 70% MeOH.Tar éis lártheifneoraithe, bailíodh an súthaire.Ansin nite na coirníní uair amháin le 100 μl de 70% MeOH agus comhthiomsaíodh na sútháin.Triomaíodh samplaí i bhfolús-tiúchantóir Speedvac agus stóráiltear iad ag -20°C go dtí go ndéanfaí anailís orthu.
Chun peiptídí modhnaithe ocsaigine singlet a aithint agus a chainníochtú, rinneadh samplaí a aththuaslagadh in aigéad formach 0.1% agus rinneadh anailís ar 1 μg de pheptídí ag baint úsáide as mais-speictriméadar Orbitrap Fusion Lumos Tribrid atá feistithe le foinse nana ESI ó Tune agus Xcalibur ó bhogearraí díoltóra 4.3.Scaradh na samplaí ar cholún ribeach 75 µm × 15 cm pacáilte go hinmheánach le hábhar 3 µm C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) agus ceangailte le córas EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Scaradh na peptídí le crómatagrafaíocht grádán líneach 95 nóiméad ó 8% tuaslagóir B go 50% tuaslagóir B (A = 0.1% aigéad formach in uisce, B = 0.1% aigéad formach i 80% acetonitrile), ansin méadaíodh go líneach go 98% B min. i 6 nóiméad ag ráta sreafa 300 nl/nóim.Bailíonn Orbitrap Fusion Lumos sonraí gach re seach idir scanadh iomlán MS agus scanadh MS2 ag brath ar na sonraí.Socraíodh an voltas sputtering go 2.1 kV agus ba é 320 °C teocht an ribeadáin iompair ian.Bailíodh speictream MS (350-2000 m/z) le taifeach 120,000, AGC 4 × 105, agus uas-am ionchuir 150 ms.Rinneadh na 10 réamhtheachtaithe luchtaithe iolraithe is coitianta i ngach scanadh iomlán a roinnt ag baint úsáide as HCD le fuinneamh imbhuailte normalaithe de 30%, fuinneog leithlisithe ceathairphoill de 1.6 m/z, agus socrú taifeach 30,000.Sprioc AGC do mhais-speictriméadracht tandem ag úsáid 5×104 agus uas-am ionchuir 150 ms.Socraítear an eisceacht dinimiciúil go 30 soicind. Diúltaíodh iain neamhshannta nó iad siúd a bhfuil muirear 1+ agus >7+ orthu le haghaidh MS/MS. Diúltaíodh iain neamhshannta nó iad siúd a bhfuil muirear 1+ agus >7+ orthu le haghaidh MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ agus >7+ были отклонены для МС/МС. Diúltaíodh iain nó iain neamhshannta le lucht 1+ agus >7+ do MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ cliceáil grianghraif níos mó a fheiceáil未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ cliceáil grianghraif níos mó a fheiceáil Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ agus >7+ были отклонены для МС/МС. Diúltaíodh iain nó iain neamhshonraithe le luchtanna 1+ agus >7+ do MS/MS.
Próiseáiltear na sonraí amh ag baint úsáide as an ardán ríomhaireachta FragPipe bunaithe ar MSFragger.Cinneadh laofachtaí mais agus aimínaigéid chomhfhreagracha ag baint úsáide as algartam cuardaigh oscailte le lamháltas mais réamhtheachtaithe de -150 go 500 Da.Aithníodh peiptídí modhnaithe ansin ag baint úsáide as modhnuithe histidine le gnóthachain mais de +229.0964 agus +247.1069 Da in PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Plátáladh cealla a léirigh na géine miniSOG comhleádh i miasa 6 cm.Nuair a shroich siad ~80% cumar, nite cealla uair amháin le HBSS (Gibco, #14025092), ansin gortha le tóireadóirí ceimiceacha i HBSS ar feadh 1 uair ag 37°C agus soilsithe le solas gorm.10W LED ar feadh 20 nóiméad ag teocht an tseomra.Chun a chinneadh cén cineál speiceas ocsaigin imoibríoch atá i gceist le PDPL, 0.5 mM vitimín C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Cuireadh mannitol 100 mM (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 leis na cealla mar fhorlíontaí.Tar éis níocháin le PBS fuar, scríobadh cealla, a bailíodh i feadáin lártheifneoir 1.5 ml, agus sonicated le tip ar feadh 1 nóiméad i 200 μl de PBS le inhibitor protease 1x gan EDTA (1 s agus 1 s sin, aimplitiúid 35%).Rinneadh an meascán mar thoradh air a lártheifneoiriú ag 15,871 × g ar feadh 10 nóiméad ag 4 °C agus coigeartaíodh an tiúchan supernatant go 1 mg/ml ag baint úsáide as trealamh measúnaithe próitéin BCA.Goradh thart ar 50 µl den lysate thuas le 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, uimh. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, agus 1 mM CuSO4 ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra le rothlú ó bhun go barr.Tar éis an imoibriú cliceáil, rinneadh deascadh le haicéatón trí 250 μl aicéatón réamh-fhuaraithe a chur leis na samplaí, gor ag -20 ° C ar feadh 20 nóiméad agus lártheifneoiriú ag 6010 × g ar feadh 10 nóiméad ag 4 ° C.Bailigh an milleán agus boil i 50 µl de mhaolán 1x Laemmli ar feadh 10 nóiméad ag 95 °C.Rinneadh anailís ansin ar shamplaí ar glóthacha fada SDS-PAGE agus léiríodh iad ag baint úsáide as an gcóras íomháithe Bio-rad ChemiDoc MP Touch le bogearraí Image Lab Touch.
Rinneadh léiriú agus íonú na próitéine miniSOG-6xHis athchuingreach mar a thuairiscítear roimhe seo.Go hachomair, rinneadh claochlú ar chealla E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) le pET21a-miniSOG-6xHis agus tionscnaíodh léiriú próitéine le 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Tar éis lysis cille, íonaíodh próitéiní ag baint úsáide as coirníní agarose Ni-NTA (MCE, uimh. 70666), scagdhealaithe i gcoinne PBS, agus stóráilte ag -80 ° C.
Le haghaidh measúnacht chóngarachta lipéad in vitro atá bunaithe ar antasubstaintí, meascadh 100 μM miniSOG íonaithe, 1 mM probe 3, agus 1 μg antashubstaint mhonaclónach luiche frith-lipéid (TransGen, #HT501-01) i PBS go dtí méid imoibrithe iomlán de 50 μl..Bhí an meascán imoibrithe ionradaithe le solas LED gorm ar feadh 0, 2, 5, 10, agus 20 nóiméad ag teocht an tseomra.Goradh an meascán le 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, agus 1 mM CuSO4 ar feadh 1 h ag teocht an tseomra ar chroiteoir gluaisne aníos.Tar éis imoibriú snap, cuir 4x maolán Laemmli go díreach leis an meascán agus boil ag 95 ° C ar feadh 10 nóiméad.Rinneadh anailís ar shamplaí ar glóthacha SDS-PAGE agus rinneadh anailís orthu trí blotting an iarthair le streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Baineadh úsáid as peptide sintéiseach ina raibh histidine le amúchadh C-críochfort (LHDALDAK-CONH2) chun anailís a dhéanamh ar lipéadú in vitro peptide-bhunaithe in aice láimhe.Sa mheasúnacht seo, meascadh peptide sintéiseach 100 μM íonaithe miniSOG, 10 mM probe 3 agus 2 μg/ml i PBS i dtoirt imoibrithe iomlán de 50 μl.Bhí an meascán imoibrithe ionradaithe le solas stiúir gorm ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra.Rinneadh anailís ar mhicriliter sampla amháin ag baint úsáide as córas LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Eitilte mais-speictriméadar le bogearraí anailíse speictrim MassLynx).
Síolaíodh cealla HEK293T a léirigh an ghéin chomhleá miniSOG go cobhsaí i miasa 10 cm le haghaidh línte le logánú organelle éagsúla (Mito, ER, Nucleus) agus miasa 15 cm le haghaidh línte Parkin-miniSOG agus BRD4-miniSOG.Nuair a shroich siad cumar ~ 90%, nite na cealla uair amháin le HBSS, ansin gortha le taiscéalaí 3 in HBSS ar feadh 1 uair ag 37°C agus soilsithe le stiúir gorm 10 W ag teocht an tseomra.Le haghaidh lipéadú neamhtheagmhála ar Parkin, cuireadh 10 µM prótón carbónil-cianíde iompróir m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) le taiscéalaí 3 in HBSS ar feadh 1 uair ag 37°C.Bhí na céimeanna lysis cille, ceimic cliceáil, laghdú agus alkylation mar an gcéanna mar a thuairiscítear thuas, ach amháin gur cuireadh 2 mg de lysate leis agus baineadh úsáid as biotin PEG3 azide san imoibriú cliceáil in ionad biotin azide fóta-dhíghrádaithe.Tar éis saibhriú, nitear na coirníní 3 huaire le 5 ml de PBS ina bhfuil 0.2% SDS, 3 huaire le 5 ml de PBS ina bhfuil 1 M úiré, agus 3 huaire le 5 ml de PBS.Ina dhiaidh sin, cuireadh 2 µg trypsin le 300 µl 25 mM ABC ina raibh 1 M úiré chun an phróitéin a scoilt thar oíche ag 37°C.Stopadh an t-imoibriú trí aigéad formach a chur leis go dtí gur shroich pH 2-3.Tar éis trypsinization ar choirníní, díshalannaíodh an tuaslagán peptíde ag baint úsáide as colún SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) agus triomaíodh é i bhfolús-tiúchantóir Speedvac.Aththuaslagadh peptides in aigéad formach 0.1% agus rinneadh anailís ar 500 ng de pheptídí ag baint úsáide as mais-speictriméadar Orbitrap Fusion Lumos Tribrid atá feistithe leis an bhfoinse nana-ESI a bhfuil cur síos air thuas.Scaradh peptides ar réamhcholúin RP-HPLC tráchtála (75 μm x 2 cm) (Thermo, uimh. 164946) agus colúin anailíseacha RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, uimh. 164941), an dá líonadh le 2 μm.grádán ó 8% go 35% ACN i 60 nóiméad, ansin méadú líneach go 98% B i 6 nóiméad ag ráta sreafa de 300 Nl/nóiméad.Bailíodh speictream MS (350-1500 m/z) le taifeach 60,000, AGC 4 × 105, agus uas-am ionchuir 50 ms.Rinneadh hiain roghnaithe a ilroinnt go seicheamhach ag HCD i dtimthriallta 3 s le fuinneamh imbhuailte normalaithe de 30%, fuinneog leithlisithe ceathrúpóil de 1.6 m/z, agus taifeach 15000. Sprioc AGC mais-speictriméadar tandem 5 × 104 agus uas-am insteallta as 22 ms baineadh úsáid as.Socraítear an t-eisiamh dinimiciúil go 45 soicind. Diúltaíodh iain neamhshannta nó iad siúd a bhfuil muirear 1+ agus >7+ orthu le haghaidh MS/MS. Diúltaíodh iain neamhshannta nó iad siúd a bhfuil muirear 1+ agus >7+ orthu le haghaidh MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ agus >7+ были отклонены для МС/МС. Diúltaíodh iain nó iain neamhshannta le lucht 1+ agus >7+ do MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ cliceáil grianghraif níos mó a fheiceáil未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ cliceáil grianghraif níos mó a fheiceáil Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ agus >7+ были отклонены для МС/МС. Diúltaíodh iain nó iain neamhshonraithe le luchtanna 1+ agus >7+ do MS/MS.
Bhí na céimeanna ullmhaithe samplach suas go dtí saibhriú na gcoirníní NeutrAvidin mar an gcéanna leis an anailís LC-MS/MS a gcuirtear síos air thuas.Baineadh úsáid as thart ar 50 μg de lysate mar ionchur le haghaidh rialú luchtaithe agus úsáideadh 2 mg de lysate le haghaidh imoibrithe cliceáil.Tar éis iad a shaibhriú agus a ní le neutravidin, rinneadh na próitéiní faoi cheangal a mhaolú trí 50 μl de mhaolán Laemmli a chur leis na coirníní roisín agarose agus fiuchphointe ag 95 ° C. ar feadh 5 nóiméad.Rinne SDS-PAGE anailís ar ionchur ualaigh rialaithe agus samplaí saibhrithe coirníní agus aistríodh iad chuig seicní PVDF (Millipore, #ISEQ00010) trí mhodhanna caighdeánacha blot an Iarthair.Cuireadh bac ar na seicní le bainne bearrtha 5% (Sangon, #A600669) i TBS ina raibh 0.1% tween-20 (TBST) agus goraíodh iad go seicheamhach le hantasubstaintí príomhúla agus tánaisteacha.Caolaíodh antasubstaintí príomhúla 1:1000 i mbainne bearrtha 5% i TBST agus goradh iad thar oíche ag 4°C.Baineadh úsáid as antasubstaintí tánaisteacha i gcóimheas 1:5000 agus gor iad ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra.Rinneadh na seicní a léirshamhlú trí chemiluminescence ag baint úsáide as córas íomháithe Chemidoc MP.Cuirtear gach scanadh neamhghearrtha de bhlotaí agus glóthacha san fhíor i láthair mar shonraí amh.
I measc na n-antasubstaintí príomhúla a úsáideadh sa staidéar seo bhí antashubstaint mhonaclónach frith-SFPQ coinín (CST, uimh. 71992), antasubstaint monaclónach frith-FUS coinín (CST, uimh. 67840), antasubstaint pholaclónach frith-NSUN2 coinín (Proteintech, uimh. 20854-1-). AP), antashubstaint pholaclónach frith-mSin3A coinín (Abcam, #ab3479), antasubstaint mhonaclónach frith-chlib luiche (TransGen, #HT201-02), antashubstaint mhonaclónach frith-β-actin luch (TransGen, #HC201-01), frith coinín -CDK2 antashubstaint mhonaclónach (ABclonal, #A0094), antashubstaint monaclónach coinín go CTBP1 (ABclonal, #A11600), antasubstaint polaclónach coinín go DUT (ABclonal, #A2901), antasubstaint polaclónach coinín go PSMC4 (ABclonal, #A2505), frith-coinín antashubstaint pholaclónach DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Úsáideadh na hantasubstaintí seo ag caolú 1:1000 i mbainne bearrtha 5% i TBST.I measc na n-antasubstaintí tánaisteacha a úsáideadh sa staidéar seo bhí IgG frith-choine (TransGen, #HS101-01), IgG frith-luch (TransGen, #HS201-01) ag caolú 1:5000.
Chun imscrúdú breise a dhéanamh ar cibé an n-idirghníomhaíonn BRD4 le SFPQ, plátáladh cealla cobhsaí HEK293T agus BRD4-miniSOG overexpressing HEK293T i miasa 10 cm.Níodh cealla le PBS fuar agus lísíodh iad i maolán lysis Pierce IP 1 ml (Thermo Fisher, #87787) le coscaire protease saor ó EDTA ar feadh 30 nóiméad ag 4°C.Ina dhiaidh sin, bailíodh na lysáití i bhfeadáin lártheifneora 1.5 ml agus lártheifneoiriú ag 15,871 xg ar feadh 10 nóiméad ag 4°C.Baineadh an súthach agus goradh é le 5 µg d’antasubstaint mhonaclónach luiche lipéadaithe frith-V5 (CST, #80076) thar oíche ag 4°C.Nigh thart ar 50 µl de choirníní maighnéadacha próitéin A/G (MCE, #HY-K0202) faoi dhó le PBS ina bhfuil 0.5% Tween-20.Ansin goradh na lysates cille le coirníní maighnéadacha ar feadh 4 huaire an chloig ag 4°C agus rothlú ón mbun go dtí an barr.Ansin nitear na coirníní ceithre huaire le 1 ml de mhaolán PBST agus bruite ag 95 ° C ar feadh 5 nóiméad.Rinneadh anailís ar shamplaí ar glóthacha SDS-PAGE agus aistríodh iad chuig seicní PVDF ag baint úsáide as modhanna caighdeánacha blotála an Iarthair.Cuireadh bac ar na seicní i mbainne bearrtha 5% i TBST agus goraíodh iad go seicheamhach le hantasubstaintí príomhúla agus tánaisteacha.Úsáideadh antashubstaint mhonaclónach frith-SFPQ antashubstainte Príomhúil (CST, #71992) ag cóimheas 1:1000 i mbainne bearrtha 5% i TBST agus gor é thar oíche ag 4°C.Úsáideadh IgG frith-choine ag cóimheas 1:5000 agus gor é ar feadh 1 uair ag teocht an tseomra.Rinneadh na seicní a léirshamhlú trí chemiluminescence ag baint úsáide as córas íomháithe Chemidoc MP.
Fuarthas na struchtúir go léir a úsáideadh don anailís ar Achar Dromchla Inrochtana Tuaslagóirí (SASA) ón mBanc Sonraí Próitéine (PDB)52 nó ó Bhunachar Sonraí Struchtúr Próitéine AlphaFold53.Ríomhadh SASA Absalóideach do gach iarmhar trí úsáid a bhaint as an gclár FreeSASA.Níor úsáideadh ach sonraí SASA iomlána gan athbhrí maidir le histidine lipéadaithe agus a chomharsana chun an meán SASA a fháil do gach struchtúr.Ríomhadh an inrochtaineacht choibhneasta tuaslagóra (RSA) do gach histidine tríd an luach absalóideach SASA a roinnt ar an achar dromchla eimpíreach uasta féideartha iarmhar atá ar fáil don tuaslagóir.Rangaíodh gach histidine mar rud folaithe ansin má bhí an meán RSA faoi bhun 20%, nó murach sin56.
Cuardaíodh comhaid amh a fuarthas i mód DDA ag baint úsáide as Proteome Discoverer (v2.5) nó MSfragger (Fragpipe v15.0) sa bhunachar sonraí próitéine fíoraithe SwissProt cuí ina raibh ábhar salaithe coitianta.Bhí trypsin iomlán ag teastáil ó na peptídí le dhá shuíomh scoilteachta in easnamh, meitiolachán carbamoyl mar mhodhnú seasta agus ocsaídiú meitiainín mar mhodhnú dinimiciúil.Socraíodh lamháltais meáchain réamhtheachtaithe agus blúirí go 10 ppm agus 0.02 Da (MS2 Orbitrap), faoi seach. Baineadh amas salaithe, agus scagadh próitéiní chun ráta fionnachtana bréagach <1% a fháil. Baineadh amas salaithe, agus scagadh próitéiní chun ráta fionnachtana bréagach <1% a fháil. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коЍожо кожони компании Baineadh amas salaithe agus scagadh próitéiní chun ráta braite bréagach <1% a thabhairt.去除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложния ложения уровня ложния ложения уровня ложения ложения уровня ложения ложения уровня ложния ложения уровня ложения ложения уровня ложения Baineadh amas salaithe agus scagadh próitéiní chun ráta dearfach bréagach <1% a bhaint amach.Le haghaidh anailís chainníochtúil gan úsáid a bhaint as lipéid, baineadh úsáid as ábhar próitéine normalaithe ó thrí athrá bitheolaíocha.Rinneadh anailís ar logánú focheallach próitéine ag baint úsáide as anailís Géine Ontology (GO) ó DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 agus bunachair shonraí a thiomsaigh agus a d'fhoilsigh an grúpa Alice Ting.Fuarthas léarscáil an bholcáin ó Perseus (v1.6.15.0). Rinneadh tástáil ar athruithe raidhse próitéine le haghaidh tábhacht staitistiúil ag baint úsáide as t-tástáil dhá thaobh, agus aithníodh amas próitéine le hathrú raidhse >2 (mura luaitear a mhalairt) agus luach p <0.05. Rinneadh tástáil ar athruithe raidhse próitéine le haghaidh tábhacht staitistiúil ag baint úsáide as t-tástáil dhá thaobh, agus aithníodh amas próitéine le hathrú raidhse >2 (mura luaitear a mhalairt) agus luach p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Rinneadh athruithe ar fhilleadh ábhair phróitéin a thástáil le haghaidh tábhacht staitistiúil trí úsáid a bhaint as t-tástáil dhá earr, agus aithníodh meaitseanna próitéine le hathrú ábhair >2 (mura dtugtar a mhalairt faoi deara) agus luach ap <0.05.使用 双边 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 变化 的 统计 显着性 并 并 蛋白质 命 中 的 丰度 丰度 变化> 2 （除非 有 说明））） 和 P 值 <0.05。使用 双边 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 变化 的 统计 并 确定 蛋白质 命 命 的 丰度 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 （另 说明）） 和 P 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Rinneadh tástáil ar thábhacht staitistiúil na n-athruithe fillte ar ábhar próitéine ag baint úsáide as t-tástáil dhá eireaball, agus socraíodh meaitseanna próitéin le haghaidh athruithe ábhar >2 (mura gcuirtear a mhalairt in iúl) agus p-luachanna <0.05.Rinneadh anailís idirghníomhaíochta próitéine ag baint úsáide as anailís GO in éineacht leis an mbunachar sonraí String.
Rinneadh trí mhacasamhlú bitheolaíochta le torthaí comhchosúla.Rinneadh anailís staitistiúil le GraphPad Prism (bogearraí GraphPad) agus gineadh ceapacha bolcán le Perseus (v1.6.15.0).Chun an dá ghrúpa a chur i gcomparáid, socraíodh p-luachanna trí úsáid a bhaint as t-tástáil dhá eireaball an Dalta.Níor áiríodh ach próitéiní singleton a aithníodh dhá uair ar a laghad sa ghrúpa turgnamhach sna ceapacha bolcáin, agus cuireadh Perseus in ionad na luachanna comhfhreagracha ar iarraidh sa ghrúpa rialaithe ó dháileadh gnáth ionas go bhféadfaí an p-luach a ríomh.Seasann barraí earráide don mheán ± diall caighdeánach.In anailísí próitéamacha le haghaidh anailís staitistiúil, coinníodh an raidhse próitéiní a bhí le feiceáil in dhá mhacasamhlú bitheolaíocha ar a laghad.Níor úsáideadh modhanna staidrimh chun méid an tsampla a réamhchinneadh.Níl na turgnaimh randamach.Ní raibh na taighdeoirí dall ar na tascanna le linn turgnamh agus meastóireachta na dtorthaí.
Le haghaidh tuilleadh eolais ar dhearadh an staidéir, féach ar an Tuarascáil Taighde Dúlra achomair atá nasctha leis an alt seo.
Cuireadh na sonraí mais-speictriméadrachta a fuarthas sa staidéar seo faoi bhráid an Cuibhreannas ProteomeXchange tríd an stór comhpháirtíochta iProX57 faoi thacar sonraí ID PXD034811 (tacar sonraí PDPL-MS).Cuirtear sonraí amh ar fáil i bhfoirm comhaid sonraí amh.Soláthraíonn an t-alt seo na sonraí bunaidh.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Eolas a chur ar an gcomharsanacht: biotinylation a bhraitheann ar ghaireacht a úsáid chun coimpléisc próitéine a shaintréithe agus orgánaigh a mhapáil. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Eolas a chur ar an gcomharsanacht: biotinylation a bhraitheann ar ghaireacht a úsáid chun coimpléisc próitéine a shaintréithe agus orgánaigh a mhapáil.Gingras, AS, Abe, KT agus Raut, B. Cur amach ar an timpeallacht: úsáid a bhaint as biotinylation atá ag brath ar ghaireacht chun coimpléisc próitéine a shaintréithe agus orgánaigh a mhapáil. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. An chomharsanacht a thuiscint: úsáid a bhaint as spleáchas na comharsanachta ar an saol bitheolaíoch.Gingras, AS, Abe, KT agus Raut, B. Tuiscint ar ghaireacht: tréithriú coimpléisc próitéine agus mapáil organelles ag baint úsáide as bithtinylation a bhraitheann gaireachta.Reatha.Mo thuairim.Ceimiceach.bitheolaíocht 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.An micri-thimpeallacht a mhapáil trí fhuinneamh Dexter a aistriú go cealla imdhíonachta.Eolaíocht 367, 1091–1097 (2020).
Tá Hertling, EL et al.Aimsíonn líonraí scála dhá phroteome athmhúnlú cille-shonrach ar an idirghníomhú daonna.Cealla 184, 3022–3040.e3028 (2021).