Nuacht

Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tacaíocht teoranta CSS ag an leagan brabhsálaí atá in úsáid agat.Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, cuirfimid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Tá meicníochtaí éagsúla tagtha chun cinn ag cealla ailse chun strus ceallacha a shárú agus leanann siad ag dul chun cinn.Is iad Próitéin kinase R (PKR) agus a ghníomhaí próitéin (PACT) na freagróirí tosaigh a dhéanann monatóireacht ar chomharthaí struis éagsúla as a dtagann cosc ​​​​ar iomadú cille agus apoptosis.Mar sin féin, tá rialáil an chonair PACT-PKR i gcealla ailse anaithnid go leor.Anseo, fuaireamar amach go bhfuil baint dhíreach ag aspartyl tRNA synthetase antisense antisense RNA 1 (DARS-AS1) le cosc ​​a chur ar an gcosán PACT-PKR agus cuireann sé iomadú cille ailse chun cinn.Ag baint úsáide as scagadh feidhmiúil ar scála mór ar lncRNA a bhaineann le hailse CRISPRi 971, fuaireamar amach go raibh baint ag DARS-AS1 le iomadú cille ailse a bhí feabhsaithe go mór.Mar sin, cuireann cnagáil DARS-AS1 bac ar iomadú cille agus cuireann sé apoptosis cille ailse chun cinn i línte cille ailse éagsúla in vitro agus laghdaítear go suntasach fás siadaí in vivo.Go meicniúil, ceanglaíonn DARS-AS1 go díreach le fearann ​​gníomhachtaithe PACT agus cuireann sé cosc ​​​​ar idirghníomhaíocht PACT-PKR, rud a laghdaíonn gníomhachtú PKR, fosfarylation eIF2α, agus cosc ​​ar bhás cille apoptotic.Go cliniciúil, cuirtear DARS-AS1 in iúl go forleathan in ailsí iolracha, agus léiríonn ró-léiriú an lncRNA seo droch-prognóis.Léiríonn an staidéar seo rialáil a bhaineann go sonrach le hailse ar an gcosán PACT-PKR ag DARS-AS1 lncRNA agus soláthraíonn sé sprioc eile maidir le prognóis agus cóireáil ailse.
Is tréith thábhachtach de mharthanas agus iomadú cille ailse é an cumas dul in oiriúint do strus.Iomadú tapa agus sainmharcanna meitibileach buaic na hailse i micri-thimpeallachtaí crua - díothacht cothaitheach, hypoxia, agus pH íseal - ar féidir leo bealaí comharthaíochta bás cille a spreagadh.Is minic a bhreathnaítear dírialú géinte atá íogair ó thaobh strus ar nós p535, próitéiní turraing teasa 6, 7, KRAS8, 9, agus HIF-110, 11, 12, 13 in ailse, rud a chuireann bac ar apoptosis agus chun maireachtáil a chur chun cinn.
Is braiteoir strus tábhachtach é Próitéin kinase R (PKR) agus fo-aonad kinase de fhachtóir tionscnaimh eucaryotic 2α (eIF2α), rialtóir aistritheach a nascann strus ceallacha le bás cille.Aithníodh PKR ar dtús mar phróitéin fhrithvíreasach trí RNA eachtrach le snáithe dúbailte (dsRNA) a bhrath.Nuair a dhéantar é a ghníomhachtú, déanann PKR fosfarylates eIF2α chun sintéis próitéin víreasach agus cheallach14,15,16 a chosc.Tá PACT (próitéin gníomhachtaithe PKR) aitheanta mar an chéad próitéin gníomhachtaithe PKR in éagmais dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Trí idirghníomhú díreach le PKR, aistríonn PACT struis éagsúla (ocras serum, sárocsaíd nó cóireáil arsainít) chuig PKR agus cosáin chomharthaíochta iartheachtacha.Chomh maith le fosfarylation eIF2α, spreagann gníomhachtú PKR PACT-idirghabhála imeachtaí éagsúla a bhaineann leis an bhfreagairt struis, lena n-áirítear stádas redox athraithe tríd an cosán PI3K/Akt24, seiceáil damáiste DNA feabhsaithe trí p5325,26 agus NF-κB27,28 Rialaíonn trascríobh, 29. Mar gheall ar a ról ríthábhachtach i bhfreagairt ar strus, iomadú, apoptosis agus próisis cheallacha tábhachtacha eile, tá PKR agus PACT ag gealladh spriocanna teiripeacha do go leor galair, go háirithe ailse30,31,32,33.Mar sin féin, in ainneoin an tábhachta pleiotrópach feidhmiúil agus bhitheolaíoch seo, tá rialáil ghníomhaíocht PACT/PKR i gcealla ailse doiléir fós.
Is tras-scríbhinní iad lncRNAnna atá níos mó ná 200 núicléatídí gan aon acmhainn códaithe próitéine.Ó tharla go bhfuil na mílte lncRNAs sainaitheanta ag tionscadail cheannródaíocha um sheicheamhú géanóim iomláin,35,36 rinneadh iarracht mhór a gcuid feidhmeanna bitheolaíocha a shoiléiriú.Tá sé léirithe ag comhlacht taighde atá ag dul i méid go bhfuil baint ag lncRNAnna le go leor próiseas bitheolaíoch37 lena n-áirítear rialáil díghníomhaithe X-chrómasóim38,39, inphriontáil40, trascríobh41,42, aistriúchán43 agus fiú fás ailse44,45,46,47.Thuairiscigh na staidéir seo go bhfuil go leor lncRNAs páirteach sa chonair PACT/PKR.Léirigh staidéar amháin dá leithéid gur chuir lncRNA ASPACT bac ar thrascríobh PACT agus gur mhéadaigh coinneáil núicléach mRNA PACT.Tá sé léirithe ag staidéir eile go gceanglaíonn lncRNA nc886 le PKR agus go gcuireann sé bac ar a fhosfarylation49,50.Go dtí seo, níor tuairiscíodh lncRNA a rialaíonn gníomhachtú PKR trí mheán PACT.
Sainaithníodh antisense antisense aspartyl-tRNA RNA 1 (DARS-AS1) mar lncRNA51,52,53,54 oncogenic.Trí rialáil miP-194-5p53, miP-12952 agus miP-532-3p51, tá sé léirithe go gcuireann DARS-AS1 fás carcinoma cille duánach soiléir cille, carcinoma thyroid agus carcinoma scamhóg neamh-bheag cille chun cinn, faoi seach.Fuair ​​Tong agus a chomhghleacaithe amach freisin go gcuireann DARS-AS1 dul chun cinn an mhiolóma chun cinn trí chobhsaíocht an mhóitíf RNA ceangailteach le próitéin 39 (RBM39) a choinneáil.Mar sin féin, ní dhearnadh aon staidéir ar cibé an bhfuil baint ag an lncRNA seo le rialáil gníomhachtaithe PACT-PKR agus freagairt strus na gcealla ailse.
Anseo, rinneamar scáileán caillteanas feidhm ar scála mór ag baint úsáide as an gcóras CRISPRi agus chinneamar go gcuireann DARS-AS1 lncRNA chun cinn iomadú cineálacha éagsúla cealla ailse.Ina theannta sin, tá meicníocht mhór aitheanta againn: ceanglaíonn DARS-AS1 go díreach le PACT, cuireann sé cosc ​​ar PACT agus PKR ceangailteach, cuireann sé cosc ​​​​ar fosfarylation de eIF2α, substráit PKR níos ísle, agus ar deireadh thiar bac ar bhás cille apoptotic.Mar fhocal scoir, nochtann ár gcuid oibre an lncRNA DARS-AS1 mar rialtóir ar an gcosán PACT-PKR agus mar sprioc ionchasach do chóireáil ailse agus prognóis.
Tá na céadta lncRNAs a bhaineann le hailse sainaitheanta ag staidéir fhairsing um phróifíliú géanóm.Mar sin féin, tá a bhfeidhm fós anaithnid den chuid is mó56.Chun iarrthóirí lncRNA a bhfuil baint acu le dul chun cinn ailse a aithint, rinneamar scáileán caillteanas feidhm le haghaidh iomadú laghdaithe i líne cille ailse cholaireicteach SW620 ag baint úsáide as an gcóras CRISPRi (Fíor 1a).Is é an ghné uathúil de na línte cille ailse drólainne SW480 agus SW620 ná go bhfuil siad díorthaithe ó siadaí bunscoile agus tánaisteacha in othar amháin.Soláthraíonn sé seo comparáid luachmhar chun staidéar a dhéanamh ar athruithe géiniteacha ar dhul chun cinn ailse drólainne chun cinn.Dá bhrí sin, rinneamar anailís ar thrasscríbhinní na línte cille ailse cholaireicteach (SW480 agus SW620) ag baint úsáide as seicheamhú RNA agus bhailigh roinnt lncRNAs feidhme féideartha ón litríocht foilsithe.Bunaithe ar na torthaí seo, dhearamar leabharlann sgRNA comhthiomsaithe ina raibh 7355 oligos sgRNA ag díriú ar 971 lncRNA a bhaineann le hailse agus 500 oligos sgRNA neamhspriocdhírithe le haghaidh rialú diúltach (Sonraí Forlíontacha 1).
Léiriú scéimreach den scagadh ag baint úsáide as an gcóras CRISPRi.b saibhriú sgRNA tar éis scagadh.Léiríonn an líne chothrománach poncaithe log2 (athrú fillte) = ±0.58.Léiríonn an líne poncaithe ingearach luach p = 0.05.Is ionann poncanna dubha agus sgRNA neamh-sprioc (ainmnithe mar NC).Is scRNAs iad na poncanna dearga a dhíríonn ar DARS-AS1.Is ionann poncanna gorma agus sgRNAs a dhíríonn ar LINC00205, lncRNA oincigineach a ndearnadh cur síos air roimhe seo.athrú fillte = (léamh normalaithe, lá 17)/(léamh normalaithe, lá 0).c DARS-AS1 sgRNA leagadh bac ar fhás cille.Léiríonn barraí earráide ± diall caighdeánach na dtrí thurgnamh.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 T-tástáil an Mhic Léinn dhá eireaball.d slonn DARS-AS1 i siadaí (tacar sonraí TCGA).em Léiriú DARS-AS1 i samplaí péireáilte gnáth agus siadaí ó othair le BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, agus COAD, faoi seach (tacar sonraí TCGA).Fuarthas p-luachanna trí úsáid a bhaint as t-tástáil péireáilte dhá earball an Mhic Léinn.
Tar éis dúinn an plasmid a thógáil agus an lentivirus a phacáistiú, d'aistrigh muid líne cille ailse cholaireicteach dCas9-SW620 leis an leabharlann thuas i gceithre thurgnamh neamhspleách ionfhabhtuithe.Ba é 0.1–0.3 an iliomad ionfhabhtaithe (MOI) do na hionfhabhtuithe seo, rud a thugann le fios nach féidir gach cill a aistriú ach le sgRNA amháin.Tar éis 18 lá de chultúr in vitro, tháinig laghdú nó méadú ar phróifíl saibhrithe na sprioc-sgRNAs tar éis scagadh, agus d'fhan líon na n-oligonucleotides rialaithe neamh-spriocdhírithe sách gan athrú i gcomparáid leis an bpróifíl réamhscagtha, rud a léiríonn go bhfuil an-scáileán sonrach ag ár sprioc. leabharlann.Rís.1b agus tábla forlíontach 1). Rinneadh LINC00205, a tuairiscíodh roimhe seo chun ailse scamhóg agus dul chun cinn ailse ae58,59,60 a chur chun cinn, a scagadh amach (log2 (foldchange) < −0.58, p luach < 0.05), ag deimhniú iontaofacht an scagthástála seo (Fíor 1b). Rinneadh LINC00205, a tuairiscíodh roimhe seo chun ailse scamhóg agus dul chun cinn ailse ae58,59,60 a chur chun cinn, a scagadh amach (log2 (foldchange) < −0.58, p luach < 0.05), ag deimhniú iontaofacht an scagthástála seo (Fíor 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). Eisiatar LINC00205, a tuairiscíodh roimhe seo chun dul chun cinn ailse scamhóg agus ailse ae58,59,60 a chur chun cinn, (log2 (athrú fillte) <-0.58, p-luach <0.05), ag deimhniú stóinseacht an scagtha seo (Fíor .1b). . Linc00205 之前 报道 可 促进 肺癌 肺癌 和 肝癌 肝癌 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 变化 变化）））））））））））） 的 可靠性 可靠性 （图 图 图 图））） 证实 了 该 筛选 的 可靠性 可靠性 （图 图 图 图 1B。。。。。 该 筛选 的 可靠性 （（图 图 1B。。。。。。 Linc00205 之前 报道 可 促进 肺癌 肺癌 和 肝癌 肝癌 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 变化 变化）））））））））））） 的 可靠性 可靠性 （图 图 图 图））） 证实 了 该 筛选 的 可靠性 可靠性 （图 图 图 图 1B。。。。。 该 筛选 的 可靠性 （（图 图 1B。。。。。。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). Eisiatar LINC00205, a tuairiscíodh roimhe seo chun dul chun cinn ailse scamhóg agus ae58,59,60 a chur chun cinn, (log2 (athrú fillte) <-0.58, p-luach <0.05), ag deimhniú stóinseacht an scagthástála seo (Fíor .1b).
I measc na lncRNAs go léir a tástáladh, scrúdaíodh DARS-AS1 freisin, agus laghdaíodh na trí oligonucleotides sgRNA gaolmhara go suntasach tar éis 18 lá de chultúr, rud a thugann le tuiscint go raibh iomadú ailse laghdaithe mar thoradh ar an lncRNA seo (Fíor 1b).Thacaigh anailís MTS i gcealla ailse cholaireicteach leis an toradh seo a léirigh nach raibh ráta fáis na gcealla laghdaithe DARS-AS1 ach leath i gcomparáid le cealla rialaithe (Fíor 1c) agus go raibh sé comhsheasmhach le tuarascálacha roimhe seo ar go leor cineálacha ailse eile.: ailse duán cille soiléir, ailse thyroid agus ailse scamhóg neamh-bheag cille51,52,53,55.Mar sin féin, tá a fheidhm agus a meicníochtaí móilíneacha in ailse cholaireicteach fós gan iniúchadh.Dá bhrí sin, roghnaigh muid an lncRNA seo le haghaidh tuilleadh staidéir.
Chun staidéar a dhéanamh ar léiriú DARS-AS1 in othair, rinneamar anailís chuimsitheach ar 10,327 sampla siadaí ón tionscadal Cancer Genome Atlas (TCGA).Léiríonn ár dtorthaí go gcuirtear DARS-AS1 in iúl go forleathan agus go ndéantar é a rialáil go mór i gcealla sláintiúla i siadaí éagsúla, lena n-áirítear adenocarcinoma colon (COAD), carcinoma cille soiléir duánach (KIRC), agus carcinoma cille papillary duánach (KIRP)..Is fíorbheagán (Fíor 1d agus Fíor Forlíontach 1a, b). Dheimhnigh anailís ar shamplaí sláintiúla/meall péireáilte léiriú i bhfad níos airde de DARS-AS1 sna siadaí de charcanóma urothelial lamhnán (BLCA), carcinoma glanchill duánach (KIRC), adenocarcinoma próstatach (PRAD), carcinoma cille squamous scamhóg (LUSC). , carcanóma endometrial corpais útarach (UCEC), adenocarcinoma scamhóg (LUAD), carcinoma hepatocellular ae (LIHC), carcinoma cille papillary duánach duánach (KIRP), agus adenocarcinoma drólainne (COAD) (luach p < 0.05) (Fíor 1e-m) . Dheimhnigh anailís ar shamplaí sláintiúla/meall péireáilte léiriú i bhfad níos airde de DARS-AS1 sna siadaí de charcanóma urothelial lamhnán (BLCA), carcinoma glanchill duánach (KIRC), adenocarcinoma próstatach (PRAD), carcinoma cille squamous scamhóg (LUSC). , carcanóma endometrial corpais útarach (UCEC), adenocarcinoma scamhóg (LUAD), carcinoma hepatocellular ae (LIHC), carcinoma cille papillary duánach duánach (KIRP), agus adenocarcinoma drólainne (COAD) (luach p < 0.05) (Fíor 1e-m) .Dheimhnigh anailís ar shamplaí sláintiúla/meall péireáilte go raibh léiriú i bhfad níos airde ar DARS-AS1 i gcarcanóma urothelial lamhnán (BLCA), carcanóma cille soiléir duánach agus duánach (KIRC), adenocarcinoma próstatach (PRAD), siadaí carcinoma cille squamous scamhóg (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , carcinoma endometrial an corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma na scamhóg (LUAD), carcinoma hepatocellular an ae (LIHC), carcinoma cille papillary an duán (KIRP), agus adenocarcinoma an colon (COAD) (luach p < 0.05) (Fíor 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 了 了 了 了 了 了 在 膀胱 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 、 肺鳞状 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 肿瘤 中 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的显着 更 表达 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （（（UCEC） 肺腺癌 肺腺癌 （LUAD） 肝肝 细胞癌 细胞癌 （（（）） 肾 乳头状 细胞癌 细胞癌 （（））） （）） （值 P 值<0.05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 了 了 了 了 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌. （kirp） (cod） (p 值<0.05）（图1e-m) .Thacaigh anailís ar shamplaí péireáilte sláintiúil/meall a thuilleadh le ról DARS-AS1 i gcarcanóma urothelial lamhnán (BLCA), carcanóma cille duánach soiléir (KIRC), adenocarcinoma próstatach (PRAD), agus siadaí carcanóma ceall squamous (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). léiriú i carcinoma corpus útarach (UCEC), adenocarcinoma scamhóg (LUAD), carcinoma hepatocellular (LIHC), carcinoma cille papillary duánach (KIRP), agus adenocarcinoma colon (COAD) (luach p <0.05) (Fíor 1e -m).Nuair a chuirtear le chéile iad, tugann na torthaí seo le fios go gcuirtear DARS-AS1 in iúl go forleathan agus go hard i réimse ailsí.
Toisc go bhfuil an tionscnóir céanna ag DARS-AS1 agus DARS (an ghéin a ionchódaíonn an snáithe antisense) agus go bhfuil siad suite in aice lena chéile, dhearamar shRNA chun DARS-AS1 a chnagadh go sonrach ach ní DARS (Fíor Forlíontach 2a,b agus Tábla Forlíontach 2 ) .Chomh maith le SW620, d'úsáideamar trí chilllíne eile a léirigh DARS-AS1 go mór chun staidéar a dhéanamh ar éifeachtúlacht agus ar fheidhm chniotála shRNA (Tábla Forlíontach 3).Léirigh ár dtorthaí gur bhain gach ceann de na trí shRNA a forbraíodh 80% ar a laghad éifeachtúlacht laghduithe DARS-AS1 amach gan mórán éifeacht ar an méid mRNA DARS (Fíor Forlíontach 2c-f).Ina theannta sin, fuaireamar amach gur chuir cnag síos DARS-AS1 leis na shRNAs seo bac suntasach ar fhás cille i línte cille ailse cholaireicteach SW620 (49.7%) agus HCT116 (27.7%), líne cille ailse chíche MBA-MD-231 (53.4%).) agus an líne cille hepatoma HepG2 (laghdú 92.7%), chomh maith lena gcumas sféir gan ancaire a fhoirmiú (laghdú meánach de ~50.8%, 44.6%, 40.7% agus 75.7% in aghaidh na líne cille) (Fíor 2a,b).I SW620, dheimhnigh torthaí an mheasúnaithe foirmiú coilíneachta a thuilleadh gur chuir DARS-AS1 shRNA bac suntasach ar iomadú cille le laghdú ar an meán de thart ar 69.6% (Fíor 2c).
Éifeacht shRNA rialaithe agus DARS-AS1 shRNA ar iomadú cille (a) agus foirmiú sféaróideach (b) i gcealla SW620, HCT116, MBA-MD-231, agus HepG2.c Éifeacht shRNA rialaithe agus shRNA DARS-AS1 ar fhoirmiú coilíneachta i gcealla SW620.Iomadú cille (d), foirmiú sféaróideach (e), agus foirmiú coilíneachta (f) de chealla SW620 ag ró-léiriú ar DARS-AS1.Is iad na sonraí a thaispeántar an meán ± diall caighdeánach de thrí thurgnamh.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, agus *** p ≤ 0.001 de réir tástála t-earball an Mhic Léinn.
Chun staidéir ar chaillteanais feidhme a chomhlánú, chruthaigh muid an chéad cheann eile de na cealla SW620 a chuir ró-bhrú DARS-AS1 (Fíor Forlíontach 2g).Dars-AS1 overexpression méadú suntasach ar fhás cille (1.8-huaire), foirmiú spheroid gan ancaire (1.4-huaire), agus foirmiú coilíneacht (3.3-huaire) i gcealla SW620 (Fig. 2d-f).Dhearbhaíomar an toradh seo ag baint úsáide as líne chillín léirithe DARS-AS1 eile, A549.Breathnaíodh an t-iomadú cille feabhsaithe seo mar gheall ar ró-eisiúint DARS-AS1 i gcealla A549 (Fíor Forlíontach 2h, i agus Tábla Forlíontach 3).Nuair a chuirtear le chéile iad, léiríonn na staidéir ghnóthachain agus caillteanais seo go gcuireann DARS-AS1 iomadú cille ailse in vitro chun cinn.
Chun iniúchadh a dhéanamh ar an mbunmheicníocht trína rialaíonn DARS-AS1 iomadú cille, rinneamar anailís tarraingthe anuas RNA chun a chomhpháirtithe féideartha ceangailteach próitéine a shainaithint.Léirigh torthaí RT-qPCR go bhfuil thart ar 86.2% de DARS-AS1 suite i gcíteaplasma cealla SW620 (Fíor Forlíontach 3a).Ansin goradh an DARS-AS1 nó pseudoRNA biotinylated biotinylated in vitro le lísáití cille SW620 agus scaradh SDS-PAGE ina dhiaidh sin.Léirigh staining airgid ina dhiaidh sin go raibh banna ar leith (~38 kDa) saibhrithe go suntasach i samplaí tarraingt DARS-AS1 ach ní i samplaí RNA caol nó coirníní (Fíor 3a).Aithníodh an banna seo mar phróitéin gníomhachtaithe PKR (PACT) ag mais-speictriméadracht (MS) agus deimhníodh é tuilleadh trí imdhíonadh i línte cille SW620, HCT116, agus HepG2 (Fíor 3a,b).Rinneadh imscrúdú freisin ar shaibhriú DARS agus próitéiní PACT gaolmhara - PKR agus TRBP - ag baint úsáide as anailís RNA ag blotáil an Iarthair (WB).Léirigh na torthaí nach bhfuarthas aon idirghníomhaíocht dhíreach idir DARS-AS1 RNA agus na trí phróitéin seo (Fíor Forlíontach 3b).Deimhníodh an idirghníomhaíocht shonrach idir DARS-AS1 agus PACT a thuilleadh le hanailís RNA immunoprecipitation (RIP), a léirigh go raibh DARS-AS1 saibhrithe go suntasach in antasubstaintí frith-PACT ach ní RNAanna rialaithe eile (Fíor 3c).Chun a fháil amach an n-idirghníomhaíonn DARS-AS1 go díreach le PACT in éagmais aon chomhpháirteanna ceallacha eile, rinneadh measúnacht in vitro bithshraith idirfheirmiméadar (BLI) ag baint úsáide as PACT íonaithe.Díluailíodh DARS-AS1 nó RNA caocha lipéadaithe biotin ar bhithbhraiteoirí streptavidin (SA) agus ansin goraíodh é i maolán cinéiteach ina raibh 1 μM PACT.Go háirithe, bhí ceangal láidir ag PACT le DARS-AS1 (luach KD ~ 26.9 nm), ach gan aithris a dhéanamh ar RNA (Fíor 3d).Nuair a chuirtear le chéile iad, léiríonn na torthaí seo idirghníomhaíocht dhíreach agus ard-chleamhnas idir DARS-AS1 agus PACT.
D'aithin anailís tarraingt RNA DARS-AS1 ag idirghníomhú le PACT i gcealla SW620.Thuas, staining airgid de phróitéiní gaolmhara.Rinneadh imdhíonadh níos ísle le antasubstaint frith-PACT.b Rinneadh anailís tarraingthe anuas RNA i gcealla HCT116 (barr) agus HepG2 (bun).Braitheadh ​​saibhriú PACT trí imdhíonadh.Rinneadh measúnachtaí imdhíonta cRNA (RIP) i gcealla SW620 ag baint úsáide as na hantasubstaintí sonraithe.d Fuarthas cuair cheangailteach PACT chuig DARS-AS1 lán-fhad nó RNA rialaithe trí úsáid a bhaint as idirfheirmiméadracht bhithshraith (BLI).Díluailíodh RNA ar bhithbhraiteoir streptavidin.Baineadh úsáid as 1 μM PACT chun comhlachas a thomhas.e Rinneadh measúnú tarraingthe RNA ag baint úsáide as DARS-AS1 fad-iomlán biotinilated nó teasctha (barr).Immunoblot ag taispeáint PACT faighte (bun).f Cuireadh PACT brataithe íonaithe gortha le DARS-AS1 fad iomlán biotinylated nó teasctha (mar atá in e) le haghaidh measúnacht RIP in vitro.Dheimhnigh RT-qPCR an RNA asbhainte.g Fuarthas cleamhnas coibhneasta blúirí RNA éagsúla le haghaidh PACT trí úsáid a bhaint as interferometry bithshraithe.Le haghaidh anailíse, baineadh úsáid as 100 nM RNA agus 1 μM RAST.h Rinneadh measúnachtaí RIP in vitro ag baint úsáide as PACT íonaithe slán nó teasctha lipéadaithe.Dheimhnigh RT-qPCR an RNA asbhainte.i Ráta fáis na gcealla SW620 a sháraíonn DARS-AS1, PACT, nó an dá rud.j Bhí éifeachtaí difriúla ar fhás cille ag ró-léiriú DARS-AS1 fad iomlán nó teasctha i gcealla SW620.k Braitheadh ​​apoptosis trí imdhíonadh le hantasubstaint frith-PARP.l Má bhaintear amach DARS-AS1 tá apoptosis de chealla SW620 mar a léirítear le cíteiméadracht sreafa.Is iad na sonraí a thaispeántar an meán ± diall caighdeánach de thrí thurgnamh. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, trí thástáil t dhá eireaball an Mhic Léinn. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, trí thástáil t dhá eireaball an Mhic Léinn. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 trí thástáil dhá earr an Mhic Léinn. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 通过双尾学生t检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 通过双尾学生t检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 trí thástáil dhá earr an Mhic Léinn.
Ghineamar ansin trí bhlúire RNA DARS-AS1 biotinylated trí thrascríobh in vitro chun an réigiún DARS-AS1 a theastaíonn le haghaidh comhlachais PACT a shainaithint (Fíor 3e).Léirigh na torthaí anailíse RNA go raibh gach blúire in ann idirghníomhú le PACT, ach léirigh an réigiún 3 '-críochfort (384-768 nucleotides lipéadaithe A3) níos mó ná 1-384 nucleotides lipéadaithe A1) ( Fíor. 3e ).Chonacthas torthaí cosúla sa mheasúnacht RIP in vitro ag baint úsáide as PACT athchuingreach (Fíor 3f).Ag teacht leis na torthaí seo, léirigh turgnaimh chun blúirí RNA díluailithe a cheangal le PACT ag baint úsáide as BLI freisin go bhfuil cleamhnas níos airde ag PACT do A3 (384-768 nt) (luach KD de thart ar 94.6 nm), cé nach bhfuil naisc ar bith beagnach le réimsí eile.(Fíor 3d).
Rinneamar scrúdú freisin ar na réigiúin cheangailteacha ghaolmhara in PACT.Tá trí fhearann ​​feidhmeacha ag PACT, dhá cheann acu atá ina bhfearainn RNA ceangailteach faoi dhó (DSRBD) agus an tríú fearann ​​(ainmnithe D3) a fheidhmíonn mar ghníomhaí idirghníomhaíochtaí próitéine.Chun cumas ceangailteach lncRNA gach fearainn a scrúdú, rinneamar innealtóireacht ar thrí shóchán a bhain gach ceann de na trí fhearann ​​agus a rinne measúnú RIP in vitro.Léirigh ár dtorthaí gur laghdaigh scriosadh an tríú fearann ​​(D3) de PACT go suntasach a idirghníomhaíocht le DARS-AS1 (faoi 0.11-huaire i gcomparáid le PACT slán) i gcomparáid leis an dá shóchán eile (Fíor 3h), léiríodh go raibh an scaoileadh de D3 idirghníomhaíonn sé le DARS.-AC1.Nuair a chuirtear le chéile iad, tugann na torthaí seo le tuiscint go bhféadfadh idirghníomhú idir DARS-AS1 agus PACT tarlú go príomha trí dheireadh 3′ DARS-AS1 agus fearann ​​D3 PACT.
Thugamar faoi deara nach raibh aon éifeacht ag DARS-AS1 ar léiriú PACT agus nach raibh aon éifeacht ag PACT ar DARS-AS1 (Fíor Forlíontach 3c).Rinneamar scrúdú ansin ar an éifeacht atá ag cnagadh PACT ar fhás ceall.I gcodarsnacht le DARS-AS1, d'fhás cealla coibhneasta 1.5-3 huaire níos tapúla nuair a leagadh PACT (Fíor Forlíontach 3d).Léirigh torthaí an mheasúnaithe foirmiú coilíneachta gur foirmíodh na cealla coilíneachtaí 2-3 huaire tar éis cóireála shRNA le PACT (Fíor Fhorlíontach. 3e).Chun tástáil a dhéanamh ar cibé an rialaíonn DARS-AS1 iomadú cille trí PACT, ghineamar cealla SW620 ag ró-bhrú PACT, DARS-AS1, nó an dá cheann.Léirigh overexpression PACT cosc ​​suntasach ar iomadú cille (Fíor 3i).Cé gur chuir ró-léiriú DARS-AS1 per se go mór chun cinn iomadú cille, ní raibh difríocht shuntasach ar bith i ráta fáis na gceall a bhí ró-léirithe ar DARS-AS1 agus PACT.Tugann na torthaí seo le fios go bhféadfadh PACT dul i ngleic leis an iomadú méadaithe de bharr ró-abairt DARS-AS1.
Ós rud é go bhfuil cumais cheangailteacha PACT éagsúla ag réigiúin éagsúla DARS-AS1, rinneamar imscrúdú ar a dtionchar coibhneasta ar iomadú cille trí ró-fhorleathadh éagsúla blúirí DARS-AS1.I gcomparáid leis an dá blúirí eile, bhí overexpressed DARS-AS1 ag deireadh 3 '(384-768 nt), an príomh-réigiún a bhaineann le PACT i DARS-AS1, a raibh an cumas is airde chun iomadú cille a spreagadh (Fíor 3j).Léiríonn na torthaí seo comhghaol dearfach idir acmhainn cheangailteach agus feidhm bhitheolaíoch DARS-AS1.
Tuairiscíodh gur próitéin atá pro-apoptotic é PACT19.Dá bhrí sin, rinneamar imscrúdú ar éifeacht DARS-AS1 ar apoptosis.De réir mar a bhíothas ag súil leis, mhéadaigh knockdown DARS-AS1 go suntasach scoilteacht PARP i gcealla SW620 agus mhéadaigh sé céatadán na gcealla iarscríbhinn V-dearfach i línte cille SW620, HCT116, HepG2, agus MBA-MD-231 (Fíor 3k).3).3f–h), rud a thugann le fios go bhfuil éifeacht frith-apoptotic DARS-AS1 i gcealla ailse contrártha le feidhm astaithe apoptóis PACT.Nuair a chuirtear le chéile iad, tugann na torthaí seo le tuiscint go bhféadfadh meicníocht fheidhm oncogenic DARS-AS1 a bheith trí chosc ar fheidhm PACT.
Ansin, rinneamar iniúchadh ar na himpleachtaí feidhmiúla a bhaineann le comhlachas DARS-AS1-PACT.Tuairiscíodh go ngníomhaíonn PACT PKR trí idirghníomhú díreach, rud a fheabhsaíonn fosfarylation eIF2α ina dhiaidh sin, rud a fhágann scriosadh aistritheach agus apoptosis17.Ar an gcéad dul síos, rinneamar scrúdú an bhfuil tionchar ag DARS-AS1 ar logánú ceallacha PACT agus PKR.Thaispeáin micreascópacht fhluaraiseachta chomhfhócasach go raibh PACT agus PKR comhlonnaithe go mór i gcealla SW620 le meánchomhéifeacht comhghaolaithe Pearson de 0.72.Idir an dá linn, laghdaigh ró-ráiteas DARS-AS1 go suntasach comhlonnú PACT agus PKR (meánchomhéifeacht comhghaolaithe Pearson 0.61) (Fíor 4a).Chun imscrúdú a dhéanamh an bhféadfadh DARS-AS1 an t-idirghníomhú PACT-PKR a mhodhnú, rinneamar measúnacht comh-imdhíonachta (comh-IP) le antasubstaint frith-PACT i lysates cille SW620.Saibhríodh PKR go mór i bhfrith-PACT i gcealla rialaithe, agus laghdaíodh aisghabháil PKR go suntasach i lysates ó chealla a bhí ró-bhrú DARS-AS1 (Fíor 4b).Úsáideadh PACT agus PKR lipéadaithe íonaithe le haghaidh measúnachtaí ceangailteach próitéine in vitro.Dá réir sin, léirigh na cinn a sholáthair DARS-AS1 ach gan aon RNA rialaithe idirghníomhaíocht PACT-PKR faoi chois (Fíor 4c).Léirigh na torthaí go léir gur chuir DARS-AS1 isteach ar chumarsáid PACT agus PKR.
breathnaíodh comhlonnú PACT agus PKR i gcealla rialaithe nó i gcealla a sháraíonn DARS-AS1 trí úsáid a bhaint as micreascópacht fluaraiseachta comhfhócasach.Bhí na núicléis dhaite le DAPI.Fuarthas torthaí staitistiúla ó 16 ghrianghraf.b Comh-imdhíon-fhuascailt (comhIP) ag baint úsáide as antashubstaint frith-PACT i lísáití cille rialaithe SW620 nó i gcealla a sháraíonn DARS-AS1.c Rinneadh PACT lipéadaithe, PKR íonaithe agus tras-scríofa in vitro le DARS-AS1 nó RNA bhréige a ghoradh le haghaidh anailíse in vitro ceangailteach próitéine.Baineadh úsáid as antasubstaintí frith-bratach le haghaidh deascadh imdhíonachta.d Rinneadh imdhíonbhlotaí leis na hantasubstaintí léirithe i gcealla SW620 agus HCT116 a aistríodh le shRNA rialaithe nó DARS-AS1-shRNA agus tar éis an t-ocras serum ina dhiaidh sin.D’athraigh leibhéil slonn DARS-AS1 íogaireacht cheallacha go thapsigargin.Aistríodh cealla SW620 le DARS-AS1 shRNA, plasmid overexpression DARS-AS1 nó plasmid rialaithe.Cóireáladh cealla le thapsigargin ar feadh 48 uair an chloig agus socraíodh inmharthanacht na gceall ag baint úsáide as an imoibrí MTS.f Baineadh úsáid as DARS-AS1 tras-scríofa in vitro nó RNA caolchúiseach agus PACT íonaithe le haghaidh measúnachta gníomhachtaithe in vitro agus braite imdhíon-blot.g Rinneadh imdhíon-bhlotaí ag baint úsáide as na hantasubstaintí seo ar chealla SW620-ctrl (ar chlé) nó ar chealla a bhí ró-léiriú ar mutants PKR (ar dheis).Aistríodh na cealla seo ansin le shRNA rialaithe nó DARS-AS1-shRNA agus ocras serum ina dhiaidh sin.h Léirigh citeiméadracht sreafa go ndearna díghníomhú an PKR mutant cúiteamh as apoptosis spreagtha DARS-AS1 i gcealla SW620.i Rinneadh imdhíonadh leis na hantasubstaintí sonraithe i gcealla SW620 (ar chlé) nó HCT116 (ar dheis).Tá cealla a aistrítear le shRNA rialaithe nó DARS-AS1 shRNA díothach ó serum agus forlíonta iad le coscaire 100 nM PKR C16 nó DMSO.Barra scála = 5 µm.Is iad na sonraí a thaispeántar an meán ± diall caighdeánach de thrí thurgnamh.* p ≤ 0.05 T-thástáil an Mhic Léinn dhá eireaball.
Creidtear go ginearálta, a luaithe a idirghníomhaíonn PACT le PKR17, gur féidir fosfarylation PKR ag Thr451 a tharlú.Thug ár dtorthaí le fios go raibh an leibhéal fosfarylation PKR ardaithe go suntasach i gcealla leagain DARS-AS1 tar éis an t-ocras serum (Fíor 4d agus Fíor Forlíontach 4a).Dá réir sin, fuair muid amach go raibh méadú suntasach freisin ar phosphorylation de eIF2α, an tsubstráit PKR is mó, ag DARS-AS1 shRNA (Fíor 4d agus Forlíontach Fíor. 4a).Is strusóir ER é Thapsigargin a fhágann go scaoileann an ER Ca2+.Tuairiscíodh go gcothaíonn cóireáil le thapsigargin léiriú agus gníomhachtú PACT, a idirghníomhaíonn agus a ghníomhaíonn PKR tuilleadh, as a dtagann apoptosis trí fhosfarylation eIF2α a mhéadú 18,61 .Anseo, d’úsáideamar thapsigargin mar spreagthóir ar an gcosán PACT/PKR le fiosrú an féidir le DARS-AS1 cabhrú le cealla strus a shárú trí chosc a chur ar an gcosán PACT/PKR.Thugamar faoi deara go raibh comhghaol dearfach idir leibhéal slonn DARS-AS1 agus friotaíocht cille in aghaidh thapsigargin.Mhair cealla SW620 a bhí ró-bhrú DARS-AS1 níos fearr nuair a cuireadh cóireáil orthu le thapsigargin, agus d’éirigh cealla le cnagadh DARS-AS1 níos so-ghabhálaí (Fíor 4e).Ag teacht leis na torthaí seo, laghdaigh ró-eisbhrú DARS-AS1 fosfarú PKR de bharr thapsigargin (Fíor Forlíontach 4b).I gcodarsnacht leis sin, tar éis cóireáil thapsigargin, bhí PKR agus eIF2α fosphorylated go pointe níos airde i gcealla knockdown DARS-AS1 i gcomparáid le cealla rialaithe (Fíor Forlíontach 4b).Is díol spéise é gur spreag thapsigargin léiriú DARS-AS1 ar bhealach dáileog-spleách, rud a d'fhéadfadh feidhm frith-strus DARS-AS1 a léiriú (Fíor Forlíontach 4c).Ina theannta sin, rinneamar measúnachtaí gníomhachtaithe in vitro chun na breathnuithe seo a dhearbhú.Go hachomair, íonaíodh PKR ó lísáití cille ag baint úsáide as antashubstaint frith-PKR, ansin gortha é le PACT athchuingreach agus DARS-AS1 trascríobh in vitro.Tar éis an imoibriú einsímeach, aimsíodh fospho-PKR ag baint úsáide as WB.Léirigh ár dtorthaí go raibh bac suntasach ag DARS-AS1 ar phosphorylation PKR, ach ní ag RNA rialaithe (Fíor 4f).Tugann na torthaí in vitro agus in vivo seo le fios go gcuireann DARS-AS1 bac ar ghníomhachtú PKR trí mheán PACT.Ag an am céanna, thugamar faoi deara freisin laghdú ar aisghabháil PACT i láthair DARS-AS1 (Fíor 4f).Tá an toradh seo comhsheasmhach le torthaí an mheasúnaithe cheangailteach próitéine in vitro (Fíor 4c) agus léiríonn sé arís feidhm bhlocála DARS-AS1 maidir le comhlachas PACT-PKR.
Tá Ser246 agus Ser287 i bhfearann ​​D3 PACT ag teastáil le haghaidh gníomhachtú PKR faoi strus ceallacha.Mar gheall ar dhá iarmhar serine a chur in ionad alanín bhí PACT mutant (mutD), a ghníomhaigh PKR in éagmais struis, agus ionadú alanine (mutA) a d'aisiompaigh an prótacal.Ós rud é gur léirigh muid tábhacht an fhearainn seo i gcomhar díreach le DARS-AS1, ghineamar an dá mutants PACT seo chun a thástáil an bhféadfadh na hiarmhair seo a bheith páirteach in idirghníomhaíocht le DARS-AS1 freisin.Suimiúil go leor, chaill an dá mutants an cumas chun ceangal le DARS-AS1 (Fíor Forlíontach 4d), le tuiscint go bhféadfadh an struchtúr iomlán an próitéin PACT a bheith ag teastáil le haghaidh idirghníomhú éifeachtach le DARS-AS1.
Ina theannta sin, tugann ár dtorthaí le fios freisin gur féidir cosc ​​​​ar iomadú cille de bharr DARS-AS1-shRNA a athbhunú go páirteach trí overexpressing tsóiteáin PACT diúltach ceannasach (PACTmutA) nó mutant PKR ceannasach diúltach (PKRmut) (Fíor Forlíontach 4e. e).Laghdaigh ró-léiriú mutants PKR ceannasach-diúltach fosfarylation PKR a tharlódh de bharr cnagadh DARS-AS1 chomh maith le fosfarylation eIF2α i gcealla serum-díothacha (Fíor 4g).Níos tábhachtaí fós, laghdaíodh comhréir na gcealla apoptotic a tharlódh de bharr cnagadh DARS-AS1 freisin i gcealla a bhí ró-bhrú PKRmut (Fíor 4h agus Fíor Forlíontach 4g).Cuireann cosc ​​ar ghníomhaíocht kinase PKR bac ar fheidhm DARS-AS1 freisin, toisc gur léirigh torthaí gur annamh a tharraing cnagadh DARS-AS1 PKR agus eIF2α fosfarylation nuair a déileáladh le cealla le coscóir PKR-sonrach C16 (Fíor 4i agus Forlíontach Fíor. 4h).).Le chéile, tugann ár dtorthaí le fios go gcuireann DARS-AS1 iomadú cille chun cinn, go páirteach ar a laghad, trí chosc a chur ar ghníomhachtú PKR trí mheán PACT.
Chun ról DARS-AS1 i tumorigenesis a iniúchadh tuilleadh, rinneamar turgnaimh in vivo ag baint úsáide as samhail xenograft luiche. Léiríonn na torthaí gur tháinig laghdú suntasach ar fhás siadaí i lucha (luach p < 0.0001) (Fíor 5a) a laghdaíodh DARS-AS1. Léiríonn na torthaí gur tháinig laghdú suntasach ar fhás siadaí i lucha (luach p < 0.0001) (Fíor 5a) a laghdaíodh DARS-AS1. Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение 1 lch). Léiríonn na torthaí go laghdaíonn cnagadh DARS-AS1 go suntasach fás siadaí i lucha (luach p < 0.0001) (Fíor 5a).结果表明, DARS-AS1, 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值<0.0001）（图5a）结果表明, DARS-AS1 agus 敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значен) (значен). Léirigh na torthaí gur laghdaigh cnagadh DARS-AS1 go suntasach fás siadaí i lucha (luach p < 0.0001) (Fíor 5a).Mar sin, sa ghrúpa cnag síos DARS-AS1, bhí laghdú suntasach ar an meánmhéid siadaí de thart ar 72.9% agus meánmhais siadaí thart ar 87.8% (Fíor 5b-d).Tugann na torthaí seo le fios go láidir gur féidir le DARS-AS1 fás siadaí in vivo a chur chun cinn go suntasach.
Éifeachtaí ad DARS-AS1 knockdown ar oncogenesis cholaireicteach i lucha nude.Taispeántar cuair fáis (a), méid siadaí (b), meáchan (c), agus íomhánna meall (d).Seasann barraí earráide do ±SEM. n = 10. ****p < 0.0001, trí thástáil dhá eireaball t an Mhic Léinn. n = 10. ****p < 0.0001, trí thástáil dhá eireaball t an Mhic Léinn. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 T-thástáil an Mhic Léinn dhá eireaball.n=10. ****p <0.0001, 通过双尾学生t 检验. ****p <0.0001, 通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 T-thástáil dhá eireaball an Mhic Léinn.e Rinne Kaplan-Meier anailís ar an gcomhghaol idir leibhéil slonn DARS-AS1 agus maireachtáil fhoriomlán in othair le UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, agus LGG.Bhí leibhéil arda de léiriú DARS-AS1 in othair sa 50% is airde;bhí an leibhéal íseal de léiriú DARS-AS1 in othair sa 50% ag an mbun.socraíodh p-luachanna ag baint úsáide as an tástáil céim loga.f Múnla molta ina rialaíonn DARS-AS1 cosán PACT-PKR agus fás siadaí.
Chun tionchar cliniciúil DARS-AS1 a thuiscint níos fearr, rinneamar scrúdú ar an gcomhghaol idir a léiriú agus maireachtáil othar.Trí anailís a dhéanamh ar thacar sonraí TCGA, fuair muid amach go raibh baint ag léiriú DARS-AS1 níos airde le melanoma uveal (UVM), crómafóibe duánach (KICH), carcinoma cille papillary duánach (KIRP), mesothelioma (MESO), ilphléacs.Bhí baint shuntasach ag maireachtáil níos ísle le morphosis glioblastoma (GBM) agus othair le glioma inchinn íseal-ghrád (LGG) (Fíor 5e).Tugann na torthaí seo le fios go bhféadfadh ról tábhachtach a bheith ag DARS-AS1 i ndul chun cinn siadaí cliniciúla agus go bhféadfadh sé a bheith ina bhithmharcóir ionchasach in aghaidh ailsí iolracha.
Sa staidéar seo, ag baint úsáide as scagadh feidhmiúil CRISPRi ar scála mór, chinneamar go sáraíonn DARS-AS1 lncRNA strus cille ailse trí dhá phríomhfhreagróir struis a rialáil, PACT agus PKR.Trí idirghníomhú go díreach le PACT, chuir DARS-AS1 bac ar ghníomhachtú PKR trí mheán PACT, rud a chuir cosc ​​ar bhás cille apoptotic agus iomadú cille a chur chun cinn (Fíor 5f).Tá uasrialáil DARS-AS1 tugtha faoi deara in ilchineálacha ailse, rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh a fheidhm chun maireachtáil cille ailse a chur chun cinn faoi choinníollacha struis a bheith infheidhme go ginearálta maidir le cineálacha iomadúla ailse.
Aithníodh PACT mar phróitéin gníomhachtaithe PKR, agus tá ról tábhachtach ag gníomhachtú PKR trí mheán PACT i bhfreagairtí struis trí thrascríobh, aistriúchán, apoptosis agus próisis cheallacha tábhachtacha eile a rialú62.Le blianta fada anuas, tá iarrachtaí déanta tuiscint a fháil ar rialáil ailse-shonrach an easghluaiseachta PACT-PKR.Anseo, léirigh ár staidéar meicníocht éagsúil rialaithe PACT-PKR i gcealla ailse trí lncRNA ceallach DARS-AS1, a cheanglaíonn go díreach le PACT, a chuireann bac ar idirghníomhaíocht PACT-PKR, a chuireann bac ar ghníomhachtú PKR agus fosfarylation eIF2α, rud a chuireann cosc ​​​​ar apoptosis de bharr strus agus ag spreagadh iomadú ailse sa deireadh.cealla.Tugann an fhionnachtain seo solas ar spriocanna lncRNA féideartha le haghaidh prognóis agus teiripe ailse.
Léirigh ár gcuid sonraí go íograíonn cnag síos DARS-AS1 cealla don ocras serum le méadú suntasach ar PKR fosfarlaithe agus eIF2α.Tugann na torthaí seo le fios go gcuireann DARS-AS1 maireachtáil cille ailse chun cinn faoi choinníollacha deacra trí ghníomhaíocht PACT/PKR a chosc.Tá baint ag roinnt RNAnna neamhchódaithe eile, mar ASPACT agus nc886, leis an ais PACT/PKR freisin trí íosrialáil a dhéanamh ar PACT48 mRNA nó trí uathfhosfaralú a rialáil trí cheangal le PKR49,50,64.Ina measc, feidhmíonn DARS-AS1 mar réabóir ar an gcomhlachas PACT-PKR.Saibhríonn an staidéar seo ár dtuiscint ar rialáil aise PACT/PKR agus ar ról na lncRNAnna i bhfreagairtí struis.
Tá trí fhearann ​​ar leith i PACT.Is leor gach ceann den chéad dá dsRBD chun ceangal ard-chleamhnas PACT le PKR a bhaint amach, agus tá an tríú fearann ​​(D3) ag teastáil le haghaidh gníomhachtú PKR in vitro agus in vivo.Léirigh ár staidéar go n-idirghníomhaíonn DARS-AS1 go fabhrach leis an bhfearann ​​​​D3 (Fíor 3h).Ag cur san áireamh méid mór an lncRNA (768 núicléatídí), is féidir le ceangal DARS-AS1 le D3 bac fisiciúil a chur ar an idirghníomhaíocht idir fearann ​​PACT dsRBD agus PKR, rud a chuireann bac ar chomhcheangal PACT agus PKR.Chuir sócháin pointe PACT a tháinig in ionad Ser246 agus Ser287 in D3 alanine nó aspartate isteach ar a chleamhnas ceangailteach do DARS-AS1, ag cur in iúl a thábhachtaí atá airíonna struchtúracha agus leictreacha foriomlána D3 ina gcomhcheangal.Beidh gá le tuilleadh sonraí faoin meicníocht seo amach anseo, ag baint úsáide as anailís bithcheimiceach níos beaichte agus anailís struchtúrach ardtaifigh PACT.
Thuairiscigh staidéir roimhe seo go gcuireann DARS-AS1 iomadú cille chun cinn trí mheicníochtaí éagsúla51,52,53.I sampla amháin, thug imscrúdaitheoirí faoi deara gur uasrialálaigh DARS-AS1 a ghéin DARS ionchódaithe próitéine antisense trí dhíriú ar miP-194-5p i gcealla ailse duán.Sa staidéar seo, áfach, ní raibh mórán éifeacht ag cnagadh DARS-AS1 ar thrascríobh DARS in ilchineálacha ailse, lena n-áirítear ar a laghad ailse cholaireicteach, chíche agus ae.Toisc go dtaispeánann lncRNAnna patrúin slonn a bhaineann go sonrach le cealla agus fíocháin, d’fhéadfadh sé nach gcaomhnófar meicníochtaí feidhmiúla trasna cineálacha ailse, rud a d’fhéadfadh cur leis an neamhréireacht seo idir ár dtuairimí agus measúnuithe roimhe seo ar ailsí éagsúla.Tá gá le staidéir speisialta chun meicníochtaí sonracha próisis fiseolaíocha agus paiteolaíocha éagsúla a shoiléiriú.
Léirigh anailís ar shonraí cliniciúla go bhfuil comhghaol contrártha idir léiriú DARS-AS1 i siadaí le maireachtáil othair ailse, rud a leagann béim ar thábhacht an ais DARS-AS1/PACT/PKR i prognóis ailse.Mar fhocal scoir, léiríonn ár staidéar go bhfuil DARS-AS1 ina rialtóir ar an ais comharthaíochta PACT/PKR, go gcuireann sé iomadú cille ailse chun cinn, agus go gcuireann sé bac ar apoptosis le linn na freagartha ar an strus, a sholáthraíonn líne taighde eile agus atá suimiúil do thaighde amach anseo ar chóireálacha féideartha. .
Fuarthas línte cille daonna SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 agus HEK293T ón mBonneagar Acmhainní Líne Cille Náisiúnta sa tSín.Coinníodh na cealla go léir i meán DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) arna fhorlíonadh le 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) agus 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ag 37 ° C, 5% CO2.gorlann.
Frith-PACT, Abcam (ab31967);Frith-PKR, Abcam (ab184257);Frith-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Frith-Bhratach, Abcam (ab125243);Frith-eIF2α, Abcam (A0764));frith-eIF2α (fosfar S51), Abcam (ab32157);frith-PACT (fosfar S246), Abgent (AP7744b);frith-β-tubulin, CST (2128);gnáth-luch IgG, CST (5415S);coinín gnáth IgG, CST (2729S).Caolaíodh antasubstaintí 1:1000 i PBST le haghaidh blotála an Iarthair agus 1:100 le haghaidh IP.
forbraíodh sgRNAs ag baint úsáide as uirlis atá ar fáil go poiblí ar a dtugtar CRISPR-ERA66.D’úsáideamar paraiméadair réamhshocraithe na huirlise d’fhorbairt sgRNA agus na suíomhanna ceangailteacha sgRNA a ríomhadh algartam sa réigiún 3 kb.dírithe ar TSS.Rinneadh linnte de oligonucleotides sgRNA a shintéisiú ag CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) agus clónáilte isteach i plasmidí pgRNA daonnaithe (Addgene #44248).Comh-aistríodh 12 µg de pgRNA plasmid daonnaithe comhthiomsaithe, 7.2 µg de psPAX2 (Addgene #12260), agus 4.8 µg de pMD2.G (Addgene #12259) go 5 x 106 HEK293T Transfection in 1fectgent Rexection. cealla ( CWBIO, Beijing, an tSín) de réir threoracha an mhonaróra.Bailíodh súiche ina raibh víreas 48 agus 72 uair tar éis aistrithe agus scagadh trí scagaire 0.45 µm.Le haghaidh scagtha, fuarthas cealla SW620 a léirigh an próitéin chomhleá dCas9/KRAB trí aistriú víreas.Bhí cealla modhnaithe SW620 ionfhabhtaithe leis an leabharlann víreas i gceithre thurgnamh ionfhabhtaithe neamhspleácha ag MOI de 0.1-0.3 agus sampláladh iad le 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) ar feadh 2 lá.Ina dhiaidh sin, saothraíodh cealla ar feadh 18 lá in vitro le clúdach leabharlainne íosta de 500 cill/sgRNA le haghaidh scagadh.
Baineadh DNA genomic de réir threoracha Kit Midi Fuil DNA QIAamp (QIAGEN, Düsseldorf, an Ghearmáin; 51183).San iomlán, baineadh úsáid as 100 μg de DNA géanóm in aghaidh an athuair bhitheolaíoch chun an leabharlann a thógáil.Méadaíodh an réigiún sgRNA le dhá bhabhta de PCR agus nasc é le barrachód.
Rinneadh táirgí PCR a íonú trí úsáid a bhaint as glóthach NucleoSpin® agus trealamh íonúcháin PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, an Ghearmáin; 740609.250) agus a chainníochtú ag baint úsáide as trealamh braite DNA dúbailte snáithe Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Baineadh úsáid as an measúnacht MTS chun iomadú cille a thomhas.Síolaíodh cealla i bplátaí 96 tobar ag dlús tosaigh de 2000 cill/tobar.Rinneadh líon coibhneasta na gceall a thomhas go laethúil ag an am sonraithe ar feadh 4-6 lá san iomlán.I gcás gach tobair, caolaíodh 20 μl d'imoibrí MTS (Promega) le 100 μl de DMEM, gortha le cealla ar feadh 4 h ag 37 ° C, agus ansin tomhaiseadh OD490.
Thángthas ar an acmhainn le haghaidh fáis gan ancaire trí anailís a dhéanamh ar fhoirmiú sféar.Go hachomair, saothraíodh 2000 cealla a aistríodh le shRNA DARS-AS1 nó shRNA rialaithe i micreaphlátaí ceangail ultra-íseal (Corning) le meánathrú gach 4 lá.Rinneadh na sféaróid a chomhaireamh tar éis 14 lá.Baineadh úsáid as 500 ceall a aistríodh leis an plasmid overexpression DARS-AS1 nó le plasmid rialaithe don mheasúnú feabhsaithe, nó níor athraíodh an modh.
Trascríobhadh RNA ag baint úsáide as T7 RNA polymerase agus biotin-16-UTP (Roche 1138908910) de réir threoracha Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Tá na primers a úsáidtear anseo liostaithe i dTábla Forlíontach 4.
Clónáladh réigiúin PACT nó PKR códaithe próitéine isteach i pET15b (Addgene #73619) agus rinneadh iad a chlaochlú go BL21(DE3).Goradh na baictéir thar oíche i LB a soláthraíodh le ampicillin agus ansin caolaíodh iad faoi 100-huaire le LB úr.Nuair a shroich an OD600 den mheán 0.8, cuireadh 1 mM IPTG leis chun léiriú próitéine a aslú.Tar éis gor thar oíche le croitheadh ​​mín (250 rpm ag 20 ° C), bailíodh an millíní cille trí lártheifneoiriú (4000 rpm, 10 min, 4°C).Cuir an millín cille ar fionraí i maolán lysis (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) agus gor ar oighear ar feadh 30 nóiméad, ansin sonicate (15 min, 5 s ar / as, ar oighear) agus lártheifneoir (13,000 rpm)., 30 nóim, 4°С).Lódáladh an súthaire ansin ar roisín Ni-NTA (QIAGEN) 3 huaire ag 4°C, nite 4 huaire le maolán níocháin (50 mM Tris, pH 8.0, imidazole 40 mM, 250 mM NaCl) agus luadh sé 3 huaire, le iomlán. de 10 ml maolán eluent (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, imidazole 300 mM).Cinneadh próitéin íonaithe ag baint úsáide as WB agus socraíodh an tiúchan trí úsáid a bhaint as trealamh measúnaithe próitéin Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Rinneadh measúnachtaí RIP mar a thuairiscítear roimhe seo, le modhnuithe.Go hachomair, tá maolán 1x RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, inhibitor RNasin ribonuclease (Promega), PMSF (Biteicneolaíocht Beyotime), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) agus lártheifneoir ag 13,000 rpm ar feadh 15 nóiméad ag 4 °C.Ansin goradh an súthach le próitéin A+G coirníní maighnéadacha (Millipore) comhchuingeach le 5 μg d'antasubstaint frith-PACT (Abeam) nó IgG (CST).Nitear na coirníní 5 huaire le maolán RIP 5x, ansin díleáite le proteinase K (NEB).Baineadh RNA le Trizol agus arna chinneadh ag RT-qPCR.Cuirtear na primers i láthair i dTábla Forlíontach 5.
Rinneadh an measúnú RIP in vitro de réir prótacal measúnaithe RIP caighdeánach modhnaithe.Caolaíodh iomlán de 5 pmol de RNA tras-scríofa in vitro 1x le maolán RIP agus annealaíodh é ag gor ag 65°C ar feadh 5 nóiméad agus fuarú mall go teocht an tseomra ina dhiaidh sin.Glanadh 5 pmol de phróitéiní PACT ar a bhfuil lipéad brataithe slán nó sócháin ó E. coli.Gor le RNA athnuaite ar feadh 2 uair ag 4°C agus lean an nós imeachta thuas le haghaidh anailíse RIP le haghaidh IP frith-bhratach.
Le haghaidh anailíse síneadh RNA, cuireadh cealla 1 × 107 le maolán 1xRIP.Tar éis lártheifneoraithe ag 13,000 rpm ar feadh 15 nóiméad ag 4°C, rinneadh réamhchóireáil ar an bhfeochadán le 30 μl de choirníní maighnéadacha streptavidin (Beckman) ar feadh 2 h ag 4°C.Soláthraíodh tRNA giosta don lysate íonaithe ansin agus goraíodh é le 40 pmol de RNA athnuaite thar oíche ag 4°C, ansin ar feadh 2 uair eile agus cuireadh 20 μl de choirníní maighnéadacha streiptavidin nua blocáilte le BSA leis.Bhí an chéim níocháin comhdhéanta de 4 huaire le maolán 5x RIP agus 4 huaire le maolán 1x RIP.Rinneadh na próitéiní comhfhreagracha a mhaolú le maolán elution biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) agus scartha ar NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Tar éis staining airgid (Beyotime Biteicneolaíocht), rinne MS bannaí áirithe a dhíbirt agus a anailísiú.
Rinneadh anailís Co-IP chun an idirghníomhaíocht idir PACT agus PKR a thástáil.Go hachomair, ullmhaíodh lysáití fornáisiúnta trí 1 x 107 ceall lysed a chothú i maolán 1 x RIP agus ina dhiaidh sin lártheifneoiriú ag 13,000 rpm ar feadh 15 nóiméad ag 4°C.Lódaíodh lísáití le coirníní maighnéadacha próitéin A + G, comhchuingeach le 5 µg d’antasubstaint frith-PACT, agus rothlaigh go réidh iad thar oíche ag 4°C.Niteadh na coirníní 3 huaire le maolán 5 × RIP, dhá uair le maolán 1 × RIP agus eluted le maolán 1 × SDS.Rinne glóthach SDS-PAGE anailís ar an bpróitéin aisghafa agus d'aimsigh WB é.
Glanadh dhá pmol de PACT bratach agus 1 pmol de PKR ó E. coli.Caolaigh i maolán 1 × RIP agus gor le 10 pmol de RNA athnuaite ar feadh 2 uair ag 4 °C.Ina dhiaidh sin, goradh iad le próitéin A+G antashubstaint fhrith-lipéadaithe coirníní maighnéadacha maighnéadach ar feadh dhá uair an chloig sa bhreis.Ansin nite na coirníní ceithre huaire le maolán 1x RIP agus le maolán 1x SDS.D'aimsigh WB an PACT agus an PKR a tháinig as.